一种用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组及方法与流程

本发明涉及罗氏沼虾生殖相关基因的生物，特别涉及用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组及方法。

背景技术：

1、罗氏沼虾(macrobrachium rosenbergii)隶属长臂虾科(palaemonidae)、沼虾属(macrobrachium)。原产于东南亚，上世纪70年代末引进国内，因其生长快、个体大且风味鲜美，逐渐成为淡水养殖的主要品种之一。与其他甲壳类动物一样，罗氏沼虾也表现性别两态性：同龄雌、雄虾个体的大小、生长速度相差悬殊，在相同养殖条件下雄虾生长速度较雌虾快，性成熟后的个体平均体重约是雌虾的两倍；此外，经研究发现，体重仅为6克的雌虾和仅2克的雄虾也有部分个体达性成熟，这些性早熟个体提前产生配子、交配繁殖会导致大量的能量损耗，造成个体发育停滞、大小不一。因此，开展罗氏沼虾生殖发育及其调控机理的研究对罗氏沼虾产业的发展有重大意义。、nanos是一种rna结合蛋白，具有两个高度保守的锌指结构域(cchc)，其在生殖发育中起着至关重要的作用。作为一个具有母源效应的基因，nanos基因在不同物种中存在不同的同源物及调节功能，如在果蝇中，nanos基因拥有1个同源基因，该基因对生殖细胞的迁移、体细胞的抑制以及干细胞自我修复的维护起到重要作用。而在线虫(caenorhabditis elegans)中发现该基因有3种nanos同源物(nanos1、nanos2、nanos3)，其中nanos1和nanos2可维持生殖细胞的生存能力，而nanos3在雌性同体的线虫中主要控制着雌雄性别转换。在脊椎动物斑马鱼(danio rerio)中，nanos1基因在胚胎发育时期负责原始生殖细胞的存活，在成体斑马鱼中维持卵母细胞的生存，而在小鼠(mus musculus)中，nanos2和nanos3在生殖细胞生长发育中起到作用，其中敲降nanos2的基因会导致雄性小鼠的精原细胞的丧失以及精子质量的下降，而阻断nanos3的则可完全导致两性生殖细胞的发育的停滞。目前，甲壳类动物中nanos家族基因的研究较为薄弱，仅见在河南华溪蟹(sinopotamon henanense)中获得了nanos1和nanos2基因，并推测其对卵巢发育起重要调控作用，尚未发现关于罗氏沼虾nanos基因的研究

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明目的在于提供罗氏沼虾nanos1基因、扩增引物组及其应用，本发明阐明了nanos1基因在罗氏沼虾生殖发育中的重要作用，为罗氏沼虾生殖发育、性别鉴定等研究提供了理论依据和思路。

2、为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组，所述引物组包括半定量pcr扩增引物组和荧光定量pcr扩增引物组；

4、所述半定量pcr扩增引物组由2对引物组成，分别为nanos1 f、nanos1r、β-actinf、β-actin r，所述nanos1 f、nanos1 r、β-actin f、β-actin r的核苷酸序列如sed idno.1～4所示；

5、所述荧光定量pcr扩增引物组由2对引物组成，分别为nanos1 qf、nanos1 qr、β-actin qf、β-actin qr，所述nanos1 qf、nanos1 qr、β-actin qf、β-actin qr的核苷酸序列如sed id no.5～8所示；

6、所述nanos1 f、nanos1 r还可用于nanos1基因的pcr扩增和原位杂交。

7、本发明还提供一种权利要求1所述用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组的获取方法，包括以下步骤：

8、(1)测序获得罗氏沼虾转录组数据，筛选出nanos1基因的预测序列。

9、(2)随机选择罗氏沼虾健康个体的性腺，提取总rna，逆转录后获得cdna，验证筛选出的罗氏沼虾nanos1基因；

10、(3)半定量pcr扩增引物组的设计：根据步骤(2)所得的nanos1基因，设计上下游特异引物及β-actin内参引物，得到罗氏沼虾nanos1基因的半定量pcr扩增引物组；

11、(4)荧光定量pcr扩增引物组的设计：根据步骤(2)所得的nanos1基因，进行荧光定量pcr扩增引物组的设计，得到罗氏沼虾荧光定量pcr扩增引物组。

12、本发明还提供一种用于罗氏沼虾nanos1基因分析的方法，采用权利要求1所述的用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组。

13、优选地，所述基因分析的方法包括半定量pcr、荧光定量pcr、pcr和原位杂交。

14、优选地，所述pcr用于对罗氏沼虾nanos1基因进行扩增；所述pcr扩增以罗氏沼虾的性腺cdna为模板；

15、所述pcr扩增的反应条件为：94℃2min；94℃30s，57℃30s，72℃90s38个循环；72℃10min。

16、优选地，所述半定量pcr用于鉴评nanos1基因在罗氏沼虾不同组织中的表达；所述半定量pcr以罗氏沼虾不同组织的cdna为模板；

17、所述半定量pcr扩增的反应条件为：94℃2min；94℃30s，57℃30s，72℃40s 38个循环；72℃10min；

18、所述不同组织包括罗氏沼虾的脑、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺、鳃、肠、眼。

19、优选地，所述荧光定量pcr用于鉴评nanos1基因在罗氏沼虾早期发育时期的表达；

20、所述荧光定量pcr以罗氏沼虾卵、胚胎和早期发育时期的cdna为模板；所述卵包括未受精卵、受精卵、卵裂期；所述胚胎包括囊胚期、原肠胚期；所述早期发育时期包括溞状幼体期、幼体期；

21、所述荧光定量pcr扩增的反应条件为：50℃2min，95℃2min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，40个循环；溶解曲线检测：95℃15s，60℃30s，95℃15s。

22、优选地，所述原位杂交用于鉴评nanos1基因在罗氏沼虾性腺组织中的表达位置；所述原位杂交为对罗氏沼虾的性腺组织进行原位杂交。

23、本发明还提供一种权利要求1所述的用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组在调控罗氏沼虾雌性生殖细胞发育中的应用。

24、本发明还提供一种权利要求1所述的用于罗氏沼虾nanos1基因分析的引物组在罗氏沼虾早期发育时期的性别鉴定中的应用。

25、有益技术效果：本发明获得的nanos1基因，其cdna序列长2811bp，编码243个氨基酸，与中华绒螯蟹的同源性最高，与鱼类的nanos1同源性较高，与哺乳类同源性较低。nanos1在卵巢中特异表达，且nanso1 mrna在未受精卵中表达量最高，显著高于受精后及胚胎发育各期；在胚胎发育期间，受精时期表达最高，显著高于卵裂期且极显著高于胚胎发育后期；该基因在卵裂期的表达水平显著高于囊胚期至幼体期；而囊胚期至幼体之间表达水平较低且无差异。原位杂交技术检测显示，nanos1 mrna在卵原细胞及初级卵母细胞(oc1，oc2，oc3，oc4)的细胞质中表达。nanos1与罗氏沼虾雌性生殖细胞发育有着密切的关系，在罗氏沼虾的生殖发育中发挥着重要的作用，为罗氏沼虾生殖发育、性别鉴定等研究提供了理论依据和思路。