ECB脱酰基酶突变体及其在制备阿尼芬净中间体中的应用

ecb脱酰基酶突变体及其在制备阿尼芬净中间体中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种棘白菌素b脱酰基酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备阿尼芬净中间体中的应用。
(二)

背景技术：

2.近年来，真菌感染造成的死亡人数不断增加，其原因与皮质激素、细胞毒性药物、广谱抗生素及免疫抑制剂等在临床中的广泛应用有关。棘白菌素是第一类针对真菌细胞壁的抗真菌药物，能够通过抑制葡聚糖合成酶的活性来影响真菌的合成。目前，已完成临床实验并成功开发上市的棘白菌素类药物主要有卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净，它们是治疗侵袭性感染的一线抗真菌药物。
3.阿尼芬净作为第三代棘白菌素类药物具有广阔的应用前景，生物法催化制备阿尼芬净关键合成中间体——棘白菌素b母核已经成为国内外抗真菌药物研究的热点。通过棘白菌素b(ecb)脱酰基酶使ecb脱酰化往往是生产过程中的限速步骤。ecb脱酰基酶能够特异性地识别并作用于ecb的酰胺键获得关键中间体棘白菌素b母核(ecbn)。
4.目前野生型的ecb脱酰基酶的活性很低，难以满意工业化生产需求，随着分子生物学和蛋白质工程的快速发展，越来越多的蛋白质结构被解析，分子改造越来越多的从定向进化发展到半理性或理性设计中。理性设计是基于生化数据，对蛋白结构和分子建模数据进行评估后对关键位点进行特异性突变。在没有高效可用的高通量测定方法的情况下，理性设计大大减少了筛选突变文库所需的时间和精力。野生型的ecb脱酰基酶经过理性设计改造后已经能够获得较好的酶学性质，对于提高现有ecb脱酰基酶的催化活性发挥着至关重要的作用。
(三)

技术实现要素：

5.本发明目的是克服现有技术中ecb脱酰基酶活性较低的不足，提供一种催化性能明显改善的ecb脱酰基酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其，以及所述突变体在催化生成阿尼芬净医药中间体棘白菌素b母核中的应用。
6.本发明采用的技术方案是：
7.一种棘白菌素b(ecb)脱酰基酶突变体，由seq id no.1所示氨基酸序列第53位、第55位、第57位、第154位、第661位经单点突变或多点联合突变获得。
8.seq id no.1：
9.mkiktgarilalsalttmmfsasalasnayglgaqatvngsgmvlanphfpwqgaarfyrmhlkvpgrydvegaaligdpiigighnrtvawshtvstarrfvwhrlslvpgdptsyyvdgrpermrartvtvqtgsgpvsrtfhdtrygpvavmpgtfdwtpatayaitdvnagnnrafdgwlrmgqakdvralkavldrhqflpwvnviaadargealygdhsvvprvtgalaaacipapfqplyassgqavldgsrsdcalgadpdaavpgilgpaslpvrfrddyvtnsndshwlaspaaplegfprilgnertprslrtrlgldqiqqrlagtdglpgkgfttarlwqvmfgnrmhgaelarddlvalcrrqptatasngaivdltaactalsrfderadldsrgahlftefalaggirfadtfevtdpvrtprrlnttdprvrtalad
avqrlagipldaklgdihtdsrgerripihggrgeagtfnvitnplvpgvgypqvvhgtsfvmavelgphgpsgrqiltyaqstnpnspwyadqtvlysrkgwdtikyteaqiaadpnlrvyrvaqrgrggsgggsghdggyaalirrasygvphitaddfgslgfgvgyvqaednicviaesvvtangersrwfgatgpddadvrsdlfhrkaiddrvaerllegprdgvrapsddvrdqmrgfvagynhflrrtgvhrltdpacrgkawvrplseidlwrtswdsmvragsgalldgivaatpptaagpasapeapda
10.优选的，所述突变为下列之一或其中两种以上的组合：(1)第53位天冬氨酸突变为丙氨酸；(2)第55位异亮氨酸突变为苯丙氨酸；(3)第57位甘氨酸替换为蛋氨酸；(4)第154位苯丙氨酸突变为亮氨酸；(5)第661位谷氨酰胺突变为亮氨酸。
11.更为优选的，所述突变体氨基酸序列如seq id no.3所示(编码基因序列如seq id no.4所示)。
12.seq id no.3：
13.mkiktgarilalsalttmmfsasalasnayglgaqatvngsgmvlanphfpwqgaarfyrmhlkvpgrydvegaaligapfimighnrtvawshtvstarrfvwhrlslvpgdptsyyvdgrpermrartvtvqtgsgpvsrtfhdtrygpvavmpgtfdwtpatayaitdvnagnnraldgwlrmgqakdvralkavldrhqflpwvnviaadargealygdhsvvprvtgalaaacipapfqplyassgqavldgsrsdcalgadpdaavpgilgpaslpvrfrddyvtnsndshwlaspaaplegfprilgnertprslrtrlgldqiqqrlagtdglpgkgfttarlwqvmfgnrmhgaelarddlvalcrrqptatasngaivdltaactalsrfderadldsrgahlftefalaggirfadtfevtdpvrtprrlnttdprvrtaladavqrlagipldaklgdihtdsrgerripihggrgeagtfnvitnplvpgvgypqvvhgtsfvmavelgphgpsgrqiltyaqstnpnspwyadqtvlysrkgwdtikyteaqiaadpnlrvyrvaqrgrggsgggsghdggyaalirrasygvphitaddfgslgfgvgyvqaednicviaesvvtangersrwfgatgpddadvrsdlfhrkaiddrvaerllegprdgvrapsddvrdlmrgfvagynhflrrtgvhrltdpacrgkawvrplseidlwrtswdsmvragsgalldgivaatpptaagpasapeapda
14.本发明还涉及编码所述的棘白菌素b脱酰基酶突变体的基因。
15.优选的，所述编码基因核苷酸序列如seq id no.4所示。
16.本发明还涉及含有所述的棘白菌素b脱酰基酶突变体的基因的重组载体和基因工程菌。
17.所述重组表达载体可通过本领域常规方法将编码本发明所述ecb脱酰基酶突变体基因的核酸连接于各种合适载体上构建而成。所述载体可以是本领域的各种常规载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达所述的ecb脱酰基酶突变体即可。所述ecb脱酰基酶突变体基因可以操作性连接于载体中合适的调控序列的下游，以实现所述ecb脱酰基酶突变体的组成型或诱导型表达。所述载体优选质粒，更优选质粒pet28a。
18.可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选大肠杆菌e.coli bl21(de3)用于高效表达本发明所述的ecb脱酰基酶突变体。
19.本发明还涉及所述棘白菌素b脱酰基酶突变体在微生物催化制备阿尼芬净中间体中的应用。
20.具体的，所述应用为：以棘白菌素b(ecb)为反应底物，以含有所述棘白菌素b脱酰
基酶突变体的湿菌体为生物催化剂，以尿素、氯化胆碱为助溶剂，以ph 7～8磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度35～45℃、搅拌速度500～800r/min的条件下进行生物催化反应制得所述棘白菌素b母核(ecbn)中。
21.涉及的反应式如下：
[0022][0023]
所示生物催化剂可以是下形式中的任意一种：
[0024]
(1)培养所述的重组表达转化体，分离含有所述ecb脱酰基酶突变体的转化体细胞；
[0025]
(2)培养所述的重组表达转化体，分离含有所述ecb脱酰基酶突变体的转化体细胞，对含有所述ecb脱酰基酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液。
[0026]
其中所述重组表达转化体的培养为本领域常规的方法和培养条件，具体可以选用如下的步骤：对于重组大肠杆菌，优选培养基为tb培养基：胰蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，甘油5g/l，磷酸二氢钾2.31g/l，磷酸氢二钾12.54g/l，ph 7.0，优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的培养基中，于37℃、180rpm振荡培养过夜。按1～2％(v/v)的接种量接种至装有100ml tb培养基(含卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的od 600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，16℃诱导16h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用pbs洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述ecb脱酰基酶突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎后离心收集上清液，即可获得所述重组ecb脱酰基酶突变体的细胞破碎液。
[0027]
ecb脱酰基酶酶活测定方法：在40℃下，在总共1ml反应混合物种测定棘白菌素b脱酰基酶活性，该混合物由ph7.0、0.1m磷酸钾缓冲液、10％助溶剂[尿素][氯化胆碱]和0.2g/l ecb组成。反应在800rpm下反应30分钟。反应结束后，离心以终止反应。随后采用高效液相色谱仪检测产物生成。一个单位棘白菌素b脱酰基酶活性(u)定义为在40℃，ph7.0的标准条件下每分钟产生1ug棘白菌素b母核所需的酶量。比酶活(u/g)定义为每克干细胞所具有的活性。
[0028]
本发明的有益效果主要体现在：本发明以扩大催化底物口袋为基础进行理性设计，利用三维结构模拟结合酶学性质分析，提供了一种催化性能更好的ecb脱酰基酶突变
体，可用于阿尼芬净中间体的制备，为阿尼芬净的合成提供了新的途径。
(四)附图说明
[0029]
图1为野生型棘白菌素b脱酰基酶及其突变体转化生成ecbn的反应进程。
[0030]
图2为不同助溶剂对催化反应的影响。
[0031]
图3为不同助溶剂浓度对催化反应的影响。
(五)具体实施方式
[0032]
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例：
[0033]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0034]
lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl 10，ph7.0；
[0035]
tb培养基(g/l)：胰蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，磷酸二氢钾2.31，磷酸氢二钾12.54，ph7.0。接种前添加卡那霉素至终浓度50ug/ml。
[0036]
棘白菌素b脱酰基酶酶活测定方法：
[0037]
在40℃下，在总共1ml反应混合物种测定棘白菌素b脱酰基酶活性，该混合物由ph7.0、0.1m磷酸钾缓冲液和0.2g/l ecb组成。反应在800rpm下反应30分钟。反应结束后，离心以终止反应。随后采用高效液相色谱仪检测产物生成。一个单位棘白菌素b脱酰基酶活性(u)定义为在40℃，ph7.0的标准条件下每分钟产生1ug棘白菌素b母核所需的酶量。比酶活(u/g)定义为每克干细胞所具有的活性。
[0038]
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》第三版书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0039]
实施例1：ecb脱酰基酶突变体表达质粒的构建
[0040]
野生型棘白菌素b脱酰基酶由实验室保藏质粒获得，核苷酸序列如seq id no.2所示。以保藏的质粒为模板，在特定位点引入突变获得突变表达载体。
[0041]
扩增条件(50μl体系)为：25μl 2
×
phanta max buffer，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl dntps，1μl dna聚合酶(vanzyme,nanjing,china)，1μl质粒模板，再用无菌水调整反应体积至50μl。
[0042]
扩增条件为：预变性95℃10分钟，30圈循环：变性95℃30秒、退火59℃30秒、延伸72℃5分钟，最后彻底延伸72℃10分钟。
[0043]
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，在电泳检测为阳性的pcr产物中加入1μl dpni酶进行消化，在37℃下保温30分钟去除原始模板。
[0044]
设计引物如下：
[0045]
突变位点d53a上游引物f：
[0046]5′‑
tgatcggcgcgccgatcattggcattgg-3
′
[0047]
突变位点d53a下游引物r：
[0048]5′‑
atgatcggcgcgccgatcagcgcc-3
′
[0049]
突变位点i55f上游引物f：
[0050]5′‑
gacccgttcatttggattggtcac-3
′
[0051]
突变位点i55f下游引物r：
[0052]5′‑
tccaaatgaacgggtcgccgatca-3
′
[0053]
突变位点g57m上游引物f：
[0054]5′‑
atcattatgattggtcacaaccgtaccg-3
′
[0055]
突变位点g57m下游引物r：
[0056]5′‑
ccaatcataatgatcgggtcgccg-3
′
[0057]
突变位点f154l上游引物f：
[0058]5′‑
cgtgcgctggatggttggctgcgt-3
′
[0059]
突变位点f154l下游引物r：
[0060]5′‑
ccaaccatccagcgcacggttgtta-3
′
[0061]
突变位点q661l上游引物f：
[0062]5′‑
gttcgtgatctgatgcgtggtttcg-3
′
[0063]
突变位点q661l下游引物r：
[0064]5′‑
ccacgcatcagatcacgaacatcatc-3
′
[0065]
实施例2：ecb脱酰基酶突变体菌株的制备和重组蛋白的表达
[0066]
将实施例1所构建的重组表达质粒转化进入大肠杆菌e.coli bl21(de3)(购自invitrogen公司)感受态细胞，将转化购的感受态细胞涂布至含有50ug/ml卡那霉素抗性的lb琼脂平板(含有lb固体培养基的平板培养基)，37℃培养过夜(大肠杆菌感受态细胞制备及转化参照分子克隆实验室手册)，待转化子出现后挑取单克隆验证，挑选阳性转化子进行测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。
[0067]
挑取活化的菌落于100ml tb培养基中，37℃、180rpm培养2h使od 600达到0.8；所述培养基的组分为：胰蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，甘油5g/l，磷酸二氢钾2.31g/l，磷酸氢二钾12.54g/l。
[0068]
向发酵液中加入终浓度0.1mm的诱导剂iptg，转到16℃，180rpm摇床中诱导产酶；
[0069]
将发酵菌液置于50m l离心管中，于4℃、5000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体细胞；将离心后的菌体用等体积的0.1m m pbs重悬，菌悬液经适当倍数稀释后利用超声破碎仪破碎细胞，将破碎后细胞悬液置于4℃、8000rpm离心10min，收集离心上清(破碎细胞上清部分)。测定野生棘白菌素b脱酰基酶及其突变体的活力。
[0070]
实施例3：ecb脱酰基酶突变体酶活测定
[0071]
棘白菌素b脱酰基酶酶活测定方法：在40℃下，在总共1ml反应混合物中测定棘白菌素b脱酰基酶活性，该混合物由ph7.0、0.1m磷酸钾缓冲液、10％助溶剂[尿素][氯化胆碱](氯化胆碱：尿素摩尔比＝1:2)和0.2g/l ecb组成。反应在800rpm下反应30分钟。反应结束后，离心以终止反应。随后采用高效液相色谱仪检测产物生成。一个单位棘白菌素b脱酰基酶活性(u)定义为在40℃，ph7.0的标准条件下每分钟产生1ug棘白菌素b母核所需的酶量。比酶活(u/g)定义为每克干细胞所具有的活性。
[0072]
ecb脱酰基酶最佳突变体d53a/i55f/g57m/f154l/q661l(mt)，经突变后，催化口袋体积有效增大，有利于底物ecb更好的进入催化口袋内部。ecb脱酰基酶突变体酶活提高了296％，达到286.5u/g。
[0073]
实施例4：ecb脱酰基酶突变体催化生成棘白菌素b母核
[0074]
在10ml的反应体系中包含0.5mm kcl、200mg/l ecb、0.1m pbs缓冲液，粗酶液，10％助溶剂[尿素][氯化胆碱](氯化胆碱：尿素摩尔比＝1:2)。在40℃下分别反应0.5，2，4，6，8，10，12h，加入盐酸终止反应，离心取上清，通过高效液相色谱仪检测产物棘白菌素b母核的产量。
[0075]
对ecb脱酰基酶(wt)和ecb脱酰基酶突变体(mt)进行转化生成ecbn反应进程的测定，实验结果如图1所示，突变体产率和反应速度均高于野生型酶，结果进一步验证了有效腔体积较大的突变体比野生型酶具有更高的催化效率。
[0076]
实施例5：化反应中不同助溶剂及助溶剂比例的优化
[0077]
分别在催化反应中加入不同的助溶剂：二甲基亚砜(dmso)、二甲基乙酰胺(dmf)、甲醇、深度共熔溶剂[氯化胆碱][尿素](des)(氯化胆碱：尿素摩尔比＝1:2)和异丙醇，反应体系为0.5mm kcl，不同种类的助溶剂，0.2g/l ecb，0.1m pbs缓冲液，粗酶液，ph 7.0。在40℃下进行酶活测定，具体的酶活测定方法见实施例3。
[0078]
分别在10％，20％，40％，60％，80％比例的des下进行酶催化反应，反应体系为0.5mm kcl，不同比例的des，0.2g/l ecb，0.1m pbs缓冲液，粗酶液，ph 7.0。在40℃下进行酶活测定，具体的酶活测定方法见实施例3。
[0079]
结果如图2和图3所示，添加助溶剂[氯化胆碱][尿素]的效果最好，它与反应体系中的pbs缓冲液共同组成了两相催化反应体系，有助于反应的进行。其中当添加比例为10％时效果最好。
[0080]
综上，本发明以野生型棘白菌素b脱酰基酶为基础，提供了一种催化性能提高的棘白菌素b脱酰基酶突变体。本发明确认了提高催化口袋体积对于提高催化活性发挥着重要作用，对研究棘白菌素b脱酰基酶的催化机制提供了重要的线索。
[0081]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。