用于建立mtDNA编码基因条件敲除大鼠的方法

技术特征：
1.一种大鼠mtdna编码基因敲除方法，包括：选择大鼠mtdna靠近基因编码框5’端的密码子tga中碱基g或密码子caa中碱基c作为目标靶点；在目标突变碱基g/c位置上下游分别选定一个tale识别靶序列，两个tale识别靶序列中间的间隔序列为7-18bp，且不含除目标突变碱基g/c之外的碱基g/c，其中两个tale识别靶序列与间隔序列一起限定目标突变序列；筛选能够准确靶向目标位点，并使其发生高效c
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g-to-t
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a转变的ddcbe组合，从而在大鼠mtdna编码基因中引入终止密码子taa，使得蛋白翻译提前终止。2.根据权利要求1的方法，其中实现大鼠mtdna编码基因敲除的目标位点和ddcbe组合如下：nd1 g2996：mts-n-1366aa-rvdarray-c-g1333c-ugi+mts-n-1366aa-rvdarray-c-g1333n-ugi(l1333c+r1333n)nd2 g3992:l1333c+r1333nnd3 c9526:l1397c+r1397nnd4 g10230:l1333c+r1333nnd5 g11938:l1333c+r1333nnd6 g13817:l1333n+r1333ccytb g14365:l1333c+r1333ncox1 g5396:l1333c+r1333ncox2 c7021:l1333n+r1333ccox3 g8645:l1333c+r1333natp6 g8121:l1333c+r1333natp8 g7783:l1333c+r1333n。3.根据权利要求1或2所述方法在大鼠mtdna编码基因敲除的应用。4.根据权利要求3的应用，其中nd1和nd2的敲除在大鼠细胞系c6中进行。5.根据权利要求2所述方法在建立大鼠mtdna编码基因条件敲除的应用，其中将l-ddcbe和r-ddcbe序列通过p2a序列连接，构建l-ddcbe-p2a-r-ddcbe元件；克隆l-ddcbe-p2a-r-ddcbe元件到rosa26-hr-cag-lsl载体中，构建rosa26-hr-cag-lsl-ddcbe表达载体；利用crispr/cas9技术将cag-lsl-ddcbe元件插入大鼠rosa26位点，构建lsl-ddcbe ki大鼠。6.根据权利要求5的应用，其中nd1条件敲除大鼠的建立的应用在大鼠受精卵中进行。7.根据权利要求5的应用所建立的动物模型在不同组织或特定细胞类型中实现mtdna编码基因的敲除的应用。8.根据权利要求7的应用，其中nd1条件敲除大鼠与心脏组织特异性cre大鼠杂交，实现心脏组织特异性nd1敲除的应用。

技术总结
本发明提供一种用于建立mtDNA编码基因条件敲除大鼠的方法。利用DdCBE碱基编辑工具，使大鼠mtDNA编码基因密码子TGA(编码氨基酸W)或CAA(编码氨基酸Q)转变为终止密码子TAA，导致翻译提前终止。通过CRISPR/Cas9技术将Cre依赖性表达的LSL-DdCBE元件敲入大鼠Rosa26位点，建立mtDNA编码基因条件敲除大鼠。通过与Cre工具大鼠杂交，激活DdCBE的表达和编辑，从而实现组织或细胞特异性mtDNA编码基因的敲除。本发明针对mtDNA编码基因敲除的技术限制，通过DdCBE工具和Cre-loxP系统的联合应用，开发一种能够在大鼠中实现条件性敲除mtDNA编码基因的方法。的方法。


技术研发人员：马元武 齐晓龙 张旭 董伟 孔维宁 张连峰
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学实验动物研究所
技术研发日：2022.10.25
技术公布日：2023/5/4