一种用于生物体中硫离子检测的近红外荧光探针及其制备方法与应用

1.本发明申请型涉及荧光检测技术领域，具体涉及一种用于生物体中硫离子检测的近红外荧光探针的制备方法与应用。


背景技术：

2.硫是一种非金属元素，在自然界中以单质硫、硫化物和含硫气体三种主要形式存在。其中，硫化物中的单硫化物(s
2-)是生命体必不可少的基础物质，不仅是生命物质的结构组分，而且参与生物体内许多重要的合成代谢，其在生物的生长调节、解毒、防卫和抗逆等过程中起到关键的作用。但是高浓度硫离子的接触和摄入，也会产生有毒的生理和生化问题。因此，对硫离子进行直接快速灵敏的检测具有重要的意义。
3.目前用于检测s
2-的方法主要包括滴定法、电化学法、原子吸收/发射光谱法、电感耦合等离子体-质谱法等。这些方法中，有的灵敏度低、样品需求量大，有的前处理比较复杂、耗时比较长，而且很难实现实时观测。因此，发展一种可以实时快速地检测硫离子的方法十分必要。荧光探针检测技术由于其操作简单、灵敏度高、选择性好、实时快速分析、时空分辨率高等特点而被广泛应用于生物、环境及医药等领域。荧光检测法特别是荧光探针靶向识别、检测标记及成像技术已受到巨大的关注，成为了一个专门的研究领域。
4.荧光探针是实现荧光成像的重要工具。近年来，兼具波长长、选择性好、灵敏度高、水溶性好、响应速度快、细胞毒性小等优点的硫离子荧光探针仍然缺乏，且当前已知的硫离子有机小分子荧光探针在种类、功能及光谱范围等方面还无法满足生物成像应用要求。因此，开发设计具有优越光物理性质且生物应用性较好的新型s
2-荧光探针非常必要。


技术实现要素：

5.为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本发明申请提供一种用于生物体中硫离子检测的近红外荧光探针及其制备方法与应用。
6.本发明申请提供了第一方面提供了一种用于检测硫离子的荧光探针，包括以下步骤：
7.所述荧光探针为式(ⅰ)所述结构式所示：
8.9.本发明申请提供了第二方面提供了一种上述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：在式ⅱ加入nbd-c l室温下反应，用无水乙醇与二氯甲烷进行重结晶，得到式ⅰ所示的荧光探针
[0010][0011]
本发明申请提供了第三方面提供了一种试剂盒，包括上述的荧光探针，以及可接受的辅料和/或助剂。
[0012]
本发明申请提供了第四方面提供了一种上述的荧光探针或上述的试剂盒在肝癌细胞和秀丽隐杆线虫成像中的应用。
[0013]
进一步的，所述荧光探针应用于细胞的共聚焦成像。
[0014]
进一步的，所述荧光探针应用于ph7-ph8环境及生物系统中的硫离子检测。
[0015]
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明申请。
[0016]
本发明的有益技术效果：
[0017]
本发明目的在于提供一种可用于生物体中硫化物检测的荧光探针及其制备方法，该探针发射波长较长(627nm，可以有效避免生物体自发光的干扰)，毒性小，对硫离子的选择性高、灵敏度高，在磷酸盐等多种缓冲/甲醇溶液中对硫离子具有选择性识别；能够可视化检测细胞及秀丽隐杆线虫中的硫离子，直观的观察到硫离子的分布，对研究硫化物在生物体内的生理和毒性作用具有很大的实际意义。
附图说明
[0018]
图1为本发明申请中探针识别s
2-的紫外可见(左)和荧光发射(右) 光谱图；
[0019]
图2为本发明申请中探针识别s
2-的照片；
[0020]
图3为本发明申请中肝癌细胞hepg2探针荧光成像
[0021]
(a:细胞；b：细胞+探针；c：细胞+探针+10μm na2s)；
[0022]
图4为本发明申请中肝癌细胞hepg2探针荧光成像
[0023]
(a-d:不同硫离子浓度0，0.05，0.5，5mmo l/l培养线虫)；
[0024]
图5为本发明申请中荧光探针的核磁氢谱1hnmr；
[0025]
图6为本发明申请中荧光探针的核磁碳谱
13
cnmr；
[0026]
图7为本发明申请中荧光探针的高分辨质谱；
[0027]
图8为本发明申请中不同ph值对探针荧光强度的影响；
[0028]
图9为本发明申请中硫离子母液对照实验的结果。
具体实施方式
[0029]
下面将参照附图更详细地描述本发明申请的可选实施方式。虽然附图中显示了本发明申请的可选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明申请更加透彻和完整，并且能够将本发明申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。
[0030]
在本发明申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明申请。在本发明申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
[0031]
以下结合附图对用于生物体中硫离子检测的近红外荧光探针及其制备方法与应用进行详细说明，具体如下：
[0032]
一种用于检测硫离子的荧光探针，包括以下步骤：
[0033]
所述荧光探针为式(ⅰ)所述结构式所示：
[0034][0035]
一种上述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：采用环己酮，通过四步有机反应合成母体dxm-oh(式ⅱ)，再加入nbd-c l室温下反应，用无水乙醇与二氯甲烷进行重结晶，得到目标探针(式ⅰ)，合成路线如下：
[0036]
[0037][0038]
一种试剂盒，包括上述的荧光探针，以及可接受的辅料和/或助剂。
[0039]
一种上述的荧光探针或上述的试剂盒在肝癌细胞和秀丽隐杆线虫成像中的应用。
[0040]
在发明申请的一种实施方式中，所述荧光探针应用于细胞的共聚焦成像。
[0041]
在发明申请的一种实施方式中，所述荧光探针应用于ph7-ph8环境及生物系统中的硫离子检测。
[0042]
为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
[0043]
实施例1
[0044]
本发明还提供了一种用于硫离子检测的荧光探针的制备方法，制备步骤如下：
[0045]
(1)二氯甲烷、dmf及三溴化磷混合液在0℃下搅拌1小时，加入环己酮，室温搅拌14小时，加冰淬灭后调节溶液至中性，以二氯甲烷萃取干燥后真空浓缩，得中间体ⅰ。
[0046]
(2)中间体ⅰ溶解于dmf，加入2-羟基-4-甲氧基苯甲醛及碳酸铯，室温搅拌18小时，过滤，滤液洗涤真空浓缩后，柱层析纯化得中间体ⅱ。
[0047]
(3)中间体ⅱ溶于无水乙醇，加入丙二腈及少量吡啶，80℃搅拌20小时后真空浓缩，用柱层析分离纯化得中间体ⅲ。
[0048]
(4)中间体ⅲ溶于二氯甲烷，冰浴条件下加入三溴化硼的dmf溶液，氮气保护下室温搅拌18小时，反应完成后加入冰淬灭并调节溶液至中性，用二氯甲烷萃取浓缩后，用柱层析纯化得母体(dxm-oh)。
[0049]
(5)dxm-oh的二氯甲烷溶液中加入三乙胺及nbd-c l，室温下搅拌18小时，反应完成后真空浓缩，纯化得到探针(式ⅰ)。
[0050]
(6)根据权利要求2所述的一种用于硫离子检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：三溴化磷、环己酮、中间体ⅰ、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、碳酸铯、中间体ⅱ、丙二腈、中间体ⅲ、三溴化硼、dxm-oh、nbd-c l 的摩尔比为2：1：1：1：3：1：1：1：20:10:1。
[0051]
根据合成方法制备获得荧光探针，其结构式如式1所示，分子式为
[0052]c23h13
n5o5。荧光探针的核磁氢谱1hnmr、核磁碳谱
13
cnmr、高分辨质谱图如图所示。高分辨质谱(hr-ms),m/z:理论计算[c
23h13
n5o5+h]
+
[0053]
440.09954,实测440.09747；理论计算[c
23h13
n5o5+na]
+
462.08147,实测462.07935。
[0054]
试验例1
[0055]
(1)检测方法步骤如下：
[0056]
用dmso配置浓度为1mmol/l的探针母液；用蒸馏水将na2s溶解配制成浓度为100mmo l/l的硫离子母液，并逐级稀释为10mmo l/l、1mmo l/l、100μ mo l/l的硫离子溶液(现配现用)；配制pbs缓冲液/乙醇(ph＝7.4,体积比4： 1)的光谱溶液。pbs缓冲液的配制方法：取0.05mo l/l的磷酸氢二钠溶液 80ml和0.05mo l/l的磷酸二氢钾溶液20ml混匀，用少
量0.05mo l/l的磷酸或0.05mo l/l的氢氧化钠溶液调节其ph为7.4，得到浓度为0.05mo l/l的pbs 缓冲液。
[0057]
准确移取50μl探针母液到容量瓶中，加50μl1 mmo l/l硫离子母液，并加入光谱溶液稀释定容到5ml，摇匀。利用紫外可见光谱仪和荧光光谱仪测试探针及探针加s
2-溶液的光谱图(图1)。
[0058]
从图1可以看出，探针在加入硫离子后，紫外吸收峰向长波长方向移动，特征吸收峰值明显增强。单独探针的荧光发射峰比较弱，加入s
2-后，在627nm 左右产生较强的荧光发射峰。说明该探针加入后，对硫离子确实有较好的识别效果。
[0059]
(2)不同ph对探针的影响
[0060]
准确移取50μl探针母液到容量瓶中，取50μl的1mmo l/l硫离子母液，并加入不同ph值的光谱溶液稀释定容到5ml，测定荧光光谱。如附图8所示，在ph值低于9时，探针在627nm发射波长下，本身的荧光强度较微弱，但 ph值超过9，对探针的荧光强度会随ph值升高而增加。这表明探针在ph为酸性至弱碱性的环境中，探针本身的荧光对识别离子没有太大影响。考虑到探针的生物应用，选择最佳缓冲ph为7.4。
[0061]
试验例2
[0062]
干扰实验是测定探针能否较好选择识别硫离子的重要标准，将1mmo l/l 的探针母液稀释100倍作为对照，同时分别加入相同浓度的化合物(硫酸铜、亚硫酸氢钠、半胱氨酸、谷胱甘肽、甲硫氨酸)用pbs缓冲液/乙醇(ph＝7.4, 体积比4：1)的光谱溶液稀释到5ml，观察颜色和荧光变化。
[0063]
从图2可以看出，探针加入硫化钠(硫离子)溶液时，溶液的颜色发生了明显的变化，而且溶液的荧光显著增强，加入1倍其它含硫化合物的颜色和荧光强度变化很微弱。
[0064]
同时，将1mmo l/l的探针母液稀释100倍加入50μl硫离子母液作为对照，同时分别加入相同浓度的其他金属离子(ag
+
、al
3+
、cu
2+
、pb
2+
、t i
4+
、ca
2+
、 mn
2+
、cr
6+
、cr
3+
、co
2+
、cd
2+
、k
+
、fe
2+
、fe
3+
、na
+
等)，用pbs缓冲液/乙醇(ph＝7.4, 体积比4：1)的光谱溶液稀释到5ml，测定波长为627nm处荧光发射峰的强度。从图9可以看出，加入相同浓度其它离子的探针荧光强度变化很微弱，这表明该探针识别硫离子具有较好的选择性。
[0065]
试验例3
[0066]
用含10％胎牛血清的dmem培养液配成肝癌细胞hepg2的单个细胞悬液，接种到共聚焦小皿。对照组(a和b组)加入1μl去离子无菌水和 999μl的完全培养基，实验c组加入1μl的10mm的硫化钠储存液和999μl 的完全培养基，然后置于37℃细胞co2培养箱中孵育16h。用pbs缓冲清洗后，a组加入1ml的pbs缓冲液，b、c组加入999μl的pbs缓冲液和1μl 的10mm探针的混合液，将其置于37℃的细胞co2培养箱中孵育15min，用 pbs清洗后，激光共聚焦显微镜下荧光成像。图3中的硫离子荧光可以很明显的显示出硫离子在肝癌细胞hepg2中的分布。
[0067]
试验例4
[0068]
在无菌操作平台内将少量大肠杆菌op50接种到ngm培养基上， 20-25℃培养1-2d。将成虫的秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)挑至覆有大肠杆菌的ngm培养基上封口后放进20℃/25℃的恒温培养箱中培养 2-3d，待子代发育至l2期用于成像实验。
[0069]
将线虫转移至2ml小离心管，用ph7.4的pbs缓冲溶液洗涤除去多余的大肠杆菌，加
入na2s(溶液浓度依次为0、5
×
10-5
、5
×
10-4
、5
×
10-3
mo l/l) 处理线虫2h；用pbs7.4洗涤除去液体及虫体表面的s
2-残留；随后加入探针 (体系浓度为1
×
10-5
mo l/l，pbs缓冲液:乙醇体积比＝4：1)，室温下孵育 30mi n，再用ph7.4的pbs洗涤干净，利用激光共聚焦扫描显微镜进行荧光成像。从图4可以看出，红色荧光可以很明显的显示出s
2-在秀丽隐杆线虫体内的分布，且随着硫离子浓度增加，荧光强度增强。
[0070]
以上已经描述了本发明申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。