一种重组鸡干扰素α蛋白、其制备方法及应用

一种重组鸡干扰素
α
蛋白、其制备方法及应用
技术领域
1.本发明属于蛋白融合技术领域，具体涉及一种重组鸡干扰素α蛋白、其制备方法及应用。


背景技术：

2.当前对养鸡业危害最大的疾病是传染病，尤其是传染病中的病毒病，给养殖业造成了严重的经济损失。农业部早在2005年禁用了利巴韦林、金刚烷胺等抗病毒类化药在养殖业中的使用，从而使得西药受到较大的应用限制。病毒性传染病目前主要依靠疫苗来预防，然而，养殖现场病原复杂，难以对鸡群形成完全保护，如新城疫、禽流感、鸡传染性支气管炎、马立克氏病等传染性病毒疾病时有发生，给养殖业带来严重威胁。
3.干扰素(interferon，ifn)是一类能诱导动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，具有抑制病毒繁殖、调节机体免疫和抗肿瘤的功能。ifn基因分为i型和ⅱ型，i型ifn又分为α和β等型。干扰素α(ifn-α)是机体免疫细胞产生的一种细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的低分子糖蛋白。干扰素在机体的免疫系统中起着非常重要的作用。近年来，采用基因工程技术制备干扰素的报道较多，但真正实现产业化的目前获批的只有犬的干扰素，原因主要是对养殖动物的应用成本高等问题是影响产业化的关键因素。同时无论天然干扰素或重组干扰素普遍存在半衰期短，给药次数多，增加应用成本和人工成本等问题。


技术实现要素：

4.本发明旨在通过构建鸡干扰素α与白蛋白的融合基因，并克隆至表达载体上，通过温度诱导实现重组融合蛋白的表达，从而延长鸡天然干扰素α的半衰期，减少了用药次数，节约表达所用诱导剂的生产成本。
5.本发明的技术方案如下：
6.本发明提供了一种重组鸡干扰素α蛋白，由鸡干扰素α和白蛋白融合而成，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
7.上述重组鸡干扰素α蛋白的表达基因，如seq id no:1所示。
8.本发明提供了一种含有上述重组鸡干扰素α蛋白表达基因的重组表达载体。优选地，所述重组表达载体为含有重组鸡干扰素α蛋白表达基因的pbv220载体。
9.本发明还提供了一种含有上述重组鸡干扰素α蛋白表达基因的重组菌。优选地，所述重组菌为含有重组鸡干扰素α蛋白表达基因的大肠杆菌。
10.本发明提供了上述重组鸡干扰素α蛋白的制备方法，步骤如下：将上述重组鸡干扰素α蛋白表达基因构建到表达载体中，形成重组表达载体；将重组表达载体转化大肠杆菌，获得含有重组鸡干扰素α蛋白表达基因的重组菌；利用温度诱导重组菌表达，经纯化后获得重组鸡干扰素α蛋白。
11.在上述制备方法中，诱导温度选自41～42℃。优选地，诱导温度为42℃。
12.上述利用温度诱导重组菌表达的具体方法为：将重组菌在含氨苄青霉素的lb培养基中培养，培养温度为30～32℃，待od值为0.6时，将培养温度升至41～42℃，诱导培养4～6h，诱导重组菌表达。
13.本发明提供了上述重组鸡干扰素α蛋白在制备具有广谱抗病毒作用的制剂中的应用。
14.本发明提供了一种鸡用干扰素制剂，含有上述重组鸡干扰素α蛋白；该制剂还优选地包含有其它药学上可接受的佐剂，例如效价稳定保护剂等。
15.本发明的有益效果为：
16.本发明所制备的重组鸡干扰素α蛋白，延长了鸡天然干扰素α的半衰期，减少了用药次数，解决了现有干扰素半衰期短和用药次数多、应用成本高等问题，既能够节约应用成本，还能够减少人工操作次数。此外，本发明通过温度诱导即可实现重组蛋白的表达，避免了诱导剂的使用，也节约了生产成本。
附图说明
17.图1为重组质粒的双酶切鉴定电泳图；其中，泳道m：dna marker dl10000；泳道1：重组质粒双酶切电泳条带，其中，上方条带为载体片段，大小为3600bp；下方条带为融合基因片段，大小为2349bp；
18.图2为sds-page电泳检测结果；其中，泳道m：蛋白marker；泳道1：未进行42℃诱导的空菌菌体；泳道2：42℃诱导后空菌菌体；泳道3：重组菌未进行42℃诱导的菌体破碎后全菌，泳道4：重组菌在42℃诱导5h后的菌体破碎后全菌；
19.图3为重组蛋白western blot鉴定结果；其中，泳道1：空菌对照；泳道2：重组菌诱导破碎后全菌；泳道3：重组菌诱导破碎后沉淀。
具体实施方式
20.在本发明中，目的基因设计、合成，重组表达载体的构建，重组菌的构建，均可通过常规技术手段实现。本发明中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
21.实施例1
22.重组蛋白的制备：
23.(1)设计与合成目的基因
24.按照鸡干扰素α基因-连接肽-白蛋白的基因顺序设计重组蛋白基因，并在基因两端分别加上bamhi和sali两个酶切位点，形成目的基因。将设计好的目的基因后交由生工生物工程(上海)股份有限公司直接合成。目的基因的序列如下所示：
25.seq id no:1：
26.[0027][0028]
上述目的基因的表达蛋白，其氨基酸序列如下所示：
[0029]
seq id no:2：
[0030][0031]
(2)构建重组表达载体及重组菌
[0032]
将pbv220载体利用bamhi/sali双酶切，回收后，与目的基因进行连接，并转化至dh5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基平板培养过夜，取lb平板上生长的单菌落经pcr鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行双酶切鉴定，鉴定为阳性者
表示表达载体构建成功。如图1所示，重组表达载体构建成功。
[0033]
(3)温度诱导重组菌表达与鉴定
[0034]
挑取以上鉴定为阳性克隆的重组菌落，划线于含氨苄青霉素的lb培养基平板培养过夜后，挑取单菌落接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中培养，测od值在0.6左右时，将培养温度由32℃升至42℃，继续诱导培养5h，收集细菌。
[0035]
在上述表达方法的基础上，设置如下对照：ⅰ.对空菌菌体不进行42℃诱导；ⅱ.对空菌菌体进行42℃诱导；ⅲ.对重组菌不进行42℃诱导。
[0036]
经sds-page电泳检测，如图2所示，与空菌相比，重组菌在87kd左右有一条浓染的新增蛋白条带，这表明，通过温度诱导，可促使重组菌成功表达重组干扰素α蛋白。
[0037]
以鼠抗鸡α干扰素(1:3500稀释)为一抗，以山羊抗小鼠igg-hrp(1:5000稀释)为二抗，对42℃诱导的重组菌进行western blot。试验结果如图3所示：重组鸡干扰素α样品能与抗鸡干扰素α单克隆抗体发生特异性反应，在87kd左右处出现特异性条带。
[0038]
4、制备重组蛋白粗制品
[0039]
将收集的细菌于高速组织匀浆机中破碎匀浆，重复2～3次，12000r/min离心10min，去上清，收集沉淀，得到粗制重组蛋白。
[0040]
5、重组蛋白的纯化
[0041]
使用geakta pure纯化仪进行蛋白纯化。采用镍离子螯合亲和层析填料装柱，用清水清洗ni
2+
螯合亲和层析柱，再用binding buffer(20mmol/l na2hpo4·
12h2o，500mmol/l nacl，20mmol/l咪唑，ph＝8.0)平衡，在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，采用上样泵将粗制重组蛋白上样过层析柱，再用binding buffer过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到a280稳定。然后用elution buffer(20mmol/l na2hpo4·
12h2o，500mmol/l nacl，500mmol/l咪唑，ph＝8.0)收集洗脱下来的蛋白，即为纯化后的重组鸡干扰素α蛋白。
[0042]
蛋白含量检测可采用lowry法，蛋白浓度不低于20μg/ml为合格。纯化后的重组蛋白可经0.22μm过滤器过滤除菌，除菌后可进行无菌分装，2～8℃贮存。
[0043]
(一)生物学活性检测
[0044]
采用细胞病变抑制法，用vsv/wish系统，按50％病变计算效价单位。在96孔微量细胞培养板上用dmem营养液培养wish细胞，置于5％co2培养箱中，在37℃下培养12～24h，长成良好单层后，加入不同剂量(即表1中的稀释度)的重组鸡干扰素α蛋白溶液，于37℃、5％co2条件下培养24h。每次试验均设正常细胞对照孔和病毒对照孔，作为正常细胞对照和发生病变的细胞对照。24h后吸弃，再分别接种100tcid
50 vsv病毒。于37℃、5％co2条件下培养，待病毒对照孔75％以上细胞出现病变(+++)时，判定结果。
[0045]
融合蛋白对vsv致细胞病变的抑制法检测细胞病变抑制情况，如表1所示。其中，在表1中，所述干扰素稀释度，以4-5
为例，指的是干扰素加样时作的4倍的倍比稀释，4-5
与原制剂浓度(20μg/ml)相比相当于进行了4-5
倍的稀释。抑制病变积累孔数，代表每个稀疏度下的孔数为表上所列举的高稀释度到此稀释度下累计下来的抑制细胞病变孔数总和；病变孔数累计代表每个稀释度下表上所列举的低稀释度到此稀释度下累计下来的发生细胞病变孔数总和。
[0046]
表1
[0047][0048]
根据表1测得效价≥1.39
×
104iu/ml。其计算方法如下：
[0049]
干扰素效价定义：效价采用reed-muench法计算，干扰素单位以log4表示，并以log4换算成log10的倒数表示。能保护半数细胞免受病毒攻击破坏的干扰素最高稀释度的倒数，即为干扰素效价。
[0050]
具体来说：能抑制50％细胞病变的干扰素稀释度的对数(log4x)+距离比的和(假定设为y值)为干扰素稀释到4-y
时，就能保护半数细胞免受损害。这个稀释度x，即为待测样品的效价。距离比的公式如下：
[0051][0052]
经计算，因此，能抑制50％细胞病变的干扰素稀释度的对数(log4x)为6+0.88，即干扰素稀释到4-6.88
时，就能保护半数细胞免受损害。这个稀释度x，即为待测样品的效价。即：log4x＝6.88，利用对数换底公式：lgx＝6.88log4，通过查对数及反对数表，可得出x＝13873iu/ml。
[0053]
(二)半衰期测定
[0054]
采用hplc法，测定干扰素α的血药浓度与时间关系，使用origin软件处理，计算重组干扰素α蛋白在鸡体内的药代动力学参数。
[0055]
取20只21日龄体重大致相同的蛋鸡(公母各半)，颈部皮下注射重组干扰素α蛋白1ml(20μg/ml)，分别在1h、4h、8h、16h、24h、48h、96h、144h、192h、240h、320h翅下采血，置于37℃温箱静置30min，取血清，使用hplc测定干扰素α浓度。不同时间点蛋鸡血清中重组干扰素α蛋白的浓度，如下述表2所示：
[0056]
表2
[0057]
时间(h)浓度(ng/ml)0015.93
±
0.09426.21
±
0.05861.99
±
0.071679.23
±
0.062486.77
±
0.12
4874.22
±
0.089659.27
±
0.1114442.31
±
0.0919233.54
±
0.0724022.67
±
0.1332018.87
±
0.04
[0058]
经origin软件计算，蛋鸡血清中动力学参数如下：吸收半衰期t(1/2α)为8.616
±
2.100，消除半衰期t(1/2β)为158.32
±
24.04。上述结果表明，重组鸡干扰素α蛋白具有较长的半衰期，半衰期高达158h。一般认为，外源干扰素在体内的半衰期只有2～6h(参见王立红等，《干扰素γ在鸡体内的消长规律》)，因此，本发明的重组鸡干扰素α蛋白较普通干扰素的半衰期至少提高了约26倍。
[0059]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。