一种增强宿主天然免疫的化合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及化合物领域，特别是一种增强宿主天然免疫的化合物及其应用。


背景技术：

2.鉴于在抗生素耐药性不断加强的背景下，对更有效、药理性能更好的药物的需求日益增长，通过增强宿主的天然免疫来提升对病原体的防御能力是一种十分有前景的治疗方法。由于天然产物具有副作用小、耐药几率低等巨大优势，越来越多的研究人员专注于从天然产物和中草药中寻找潜在的天然免疫激活因子，以保护人体免受细菌感染。
3.天然免疫系统是我们防御微生物入侵系统的第一线，从线虫到哺乳动物，它都是进化保守的。在感染期间，天然免疫系统被激活，导致对入侵病原体的抗菌反应。秀丽隐杆线虫已成为研究天然免疫反应的有价值的模型之一。
4.在目前病原菌对抗生素耐药性不断增强的背景下，特别针对抗生素类药物开发周期长，且更新换代慢的现状，研究发现一种能够增强天然免疫的药物尤为重要，本发明利用秀丽隐杆线虫模型，通过大量天然产物进行活性筛选实验，发现了一种能够增强天然免疫的药物——brevilin a。而brevilin a增强天然免疫药物的研究，国内外未见任何报道。


技术实现要素：

5.本发明涉及一种增强宿主天然免疫的化合物及其应用。brevilin a是一种增强宿主的天然免疫的小分子化合物，具有帮助宿主抵抗病原菌的作用。
6.本发明的技术方案：一种增强宿主天然免疫的化合物,所述化合物为brevilin a，中文译名为短叶老鹳草素a，分子式c
20h26
o5，分子量346，cas为16503-32-5，结构式为：。
7.前述化合物在制备治疗增强宿主天然免疫药物中的应用。
8.前述增强宿主天然免疫是帮助宿主抵抗病原菌。
9.前述病原菌包括铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌、粪肠球菌或金黄色葡萄球菌。
10.一种增强宿主天然免疫的制剂，所述制剂包括brevilin a。
11.一种增强宿主天然免疫的制剂，所述制剂主要由brevilin a制备而成。
12.前述制剂为口服制剂。
13.前述口服制剂为片剂或胶囊剂。
14.本发明的有益效果1、本发明通过大量活性筛选实验，发现brevilin a可通过降低线虫肠道内的细菌
负荷，增强其对病原菌的抵抗力，从而具有增强宿主天然免疫的能力。疗效明确，原理清楚，说明该药物在本发明特定条件下具有显著增强宿主天然免疫的效果，有很好的临床应用前景。
15.2、将秀丽隐杆线虫培养于含有浓度为10 μm的brevilin a的nmg线虫生长培养基中，然后暴露于条件致病菌铜绿假单胞菌(pa14)的环境；秀丽隐杆线虫的最大生存时间为132h。而无brevilin a的nmg线虫生长培养基中，秀丽隐杆线虫的最大生存时间缩短为108h。
16.3、将秀丽隐杆线虫培养于含有浓度为10 μm的brevilin a的nmg线虫生长培养基中，然后暴露于肠沙门氏菌的环境；秀丽隐杆线虫的最大生存时间为216h。而无brevilin a的nmg线虫生长培养基中，秀丽隐杆线虫的最大生存时间缩短为193h。
17.4、将秀丽隐杆线虫培养于含有浓度为10 μm的brevilin a的nmg线虫生长培养基中，然后暴露于粪肠球菌的环境；秀丽隐杆线虫的最大生存时间为133h。而无brevilin a的nmg线虫生长培养基中，秀丽隐杆线虫的最大生存时间缩短为120h。
18.5、将秀丽隐杆线虫培养于含有浓度为10 μm的brevilin a的nmg线虫生长培养基中，然后暴露于金黄色葡萄球菌的环境；秀丽隐杆线虫的最大生存时间为120h。而无brevilin a的nmg线虫生长培养基中，秀丽隐杆线虫的最大生存时间缩短为108h。
19.附图说明
20.图1：在铜绿假单胞菌(pa14)的环境下线虫生存时间图；图2：在肠沙门氏菌的环境下线虫生存时间图；图3：在粪肠球菌的环境下线虫生存时间图；图4；在金黄色葡萄球的环境下线虫生存时间图；图5；把线虫暴露于能表达绿色荧光蛋白(gfp)的铜绿假单胞菌(pa14)环境下48h，线虫肠道积累情况的荧光图片（ctrl为未添加10 μm brevilin a，ba为添加有10 μm brevilin a）；图6；把线虫暴露于能表达绿色荧光蛋白(gfp)的铜绿假单胞菌(pa14)环境下48h，细菌在线虫肠道累积菌落形成单位（cfu）的量化结果图（ctrl为未添加brevilin a，ba为添加有10 μm brevilin a）。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
22.实施例1brevilin a胶囊剂的制备方法：取淀粉150g干燥，再取brevilin a 10g、硬脂酸镁5g混合均匀，填充胶囊，制成1000粒，即得brevilin a胶囊剂。
23.规格：10mg/粒。
24.用法用量：brevilin a胶囊3粒/次，3次/天。
25.功效：增强对病原菌的抵抗能力。
26.实施例2
brevilin a片剂的制备方法：取brevilin a 10g，再取淀粉140g，羧甲基纤维素钠10 g，混合加入乙醇制成颗粒，加硬脂酸镁5g混匀，压片，包糖衣，制成1000片，即得brevilin a片剂。
27.规格：10mg/片。
28.用法用量：brevilin a片剂3片/次，3次/天。
29.功效：增强对病原菌的抵抗能力。
30.本发明做了大量分析验证实验，以下为本发明实验研究的结果：1. 试药试剂nmg线虫生长培养基、m9缓冲溶液、blench裂解液，lb细菌培养基，brevilin a（中文译名为短叶老鹳草素a，brevilin a 的cas为16503-32-5）2. 实验仪器生化培养箱、细菌培养箱、摇床、正置光学显微镜、体视显微镜、荧光显微镜。
31.3. 实验方法3.1.繁殖秀丽隐杆线虫：在标准条件下饲养和繁殖秀丽隐杆线虫，秀丽隐杆线虫（n2）为bristol wild-type.4.1在致病菌下的存活率实验4.1.1铜绿假单胞菌(pa14)（1）将菌铜绿假单胞菌(pa14)培养于lb细菌培养基中，备用；（2）取nmg线虫生长培养基加入去离子水加热溶解，121℃高压灭菌30分钟，温度冷至50～55℃后，再加入不同量的brevilin a(终浓度为0 μm、5 μm、10 μm、15 μm)，冷却后nmg线虫生长培养基凝固，再将备用的菌铜绿假单胞菌(pa14)涂抹在nmg线虫生长培养基上，使线虫暴露在致病菌铜绿假单胞菌(pa14)的环境下；（3）观察秀丽隐杆线虫的生存时间，研究结果如图1显示，brevilin a加药组秀丽隐杆线虫的最大生存时间都长于未加药对照组。
32.结果：0 μm brevilin a条件时，秀丽隐杆线虫的最大生存时间为108h；5 μm brevilin a条件时，秀丽隐杆线虫的最大生存时间为120h；10μm brevilin a条件时，秀丽隐杆线虫的最大生存时间为132h；15 μm brevilin a条件时，秀丽隐杆线虫的最大生存时间为120h。
33.4.1.2肠沙门氏菌（salmonella enterica）（1）将肠沙门氏菌（salmonella enterica）培养于lb细菌培养基中，备用；（2）取nmg线虫生长培养基加入去离子水加热溶解，121℃高压灭菌30分钟，温度冷至50～55℃后，再加入不同量的brevilin a(终浓度为0 μm、5 μm、10 μm、15 μm)，再将备用的肠沙门氏菌（salmonella enterica）涂抹在nmg线虫生长培养基上，使线虫暴露在肠沙门氏菌（salmonella enterica）的环境下；（3）观察秀丽隐杆线虫的生存时间，研究结果如图2显示，10 μm brevilin a加药组秀丽隐杆线虫的最大生存时间长于未加药对照组。
34.结果：0 μm brevilin a条件时，秀丽隐杆线的最大生存时间为193h；
10 μm brevilin a条件时，秀丽隐杆线虫的最大生存时间为216h。
35.4.1.3粪肠球菌（enterococcus faecalis）（1）将粪肠球菌（enterococcus faecalis）培养于lb细菌培养基中，备用；（2）取nmg线虫生长培养基加入去离子水加热溶解，121℃高压灭菌30分钟，温度冷至50～55℃后，再加入不同量的brevilin a(终浓度为0 μm、5 μm、10 μm、15 μm)，再将备用的粪肠球菌（enterococcus faecalis）涂抹在nmg线虫生长培养基上，使线虫暴露在粪肠球菌（enterococcus faecalis）的环境下；（3）观察秀丽隐杆线虫的生存时间。研究结果如图3显示，10 μm brevilin a加药组秀丽隐杆线虫的最大生存时间长于未加药对照组。
36.结果：0 μm brevilin a条件时，秀丽隐杆线虫的最大生存时间为120h；10 μm brevilin a条件时，秀丽隐杆线虫的最大生存时间为133h。
37.4.1.4金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）（1）将金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）培养于lb细菌培养基中，备用；（2）取nmg线虫生长培养基加入去离子水加热溶解，121℃高压灭菌30分钟，温度冷至50～55℃后，再加入不同量的brevilin a(终浓度为0 μm、5 μm、10 μm、15 μm)，再将备用的金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）涂抹在nmg线虫生长培养基上，使线虫暴露在金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）的环境下；（3）观察秀丽隐杆线虫的生存时间，研究结果如图4显示，10 μm brevilin a加药组秀丽隐杆线虫的最大生存时间长于未加药对照组。
38.结果：0 μm brevilin a条件，秀丽隐杆线虫的最大生存时间为108h；10 μm brevilin a条件，秀丽隐杆线虫的最大生存时间为120h；4.1.5绿色荧光蛋白(gfp)的铜绿假单胞菌(pa14)（1）将能表达绿色荧光蛋白(gfp)的铜绿假单胞菌(pa14)培养于lb细菌培养基中，备用；（2）取nmg线虫生长培养基加入去离子水加热溶解，121℃高压灭菌30分钟，温度冷至50～55℃后，再加入不同量的brevilin a(终浓度为0 μm、5 μm、10 μm、15 μm)，再将备用的能表达绿色荧光蛋白(gfp)的铜绿假单胞菌(pa14)涂抹在nmg线虫生长培养基上，使线虫暴露在能表达绿色荧光蛋白(gfp)的致病菌铜绿假单胞菌(pa14)的环境下，暴露48小时后，利用荧光显微镜观察brevilin a是否影响细菌在线虫肠道的积累。
39.研究结果显示：10 μm brevilin a加药组线虫肠道中的绿色荧光明显少于未加药组（图5），菌落形成单位（cfu）的量化结果与其一致（图6）。上述研究说明10 μm breviilin a可通过降低线虫肠道内的细菌负荷，增强其对病原菌的抵抗力。
40.综上，本案例的研究结果发现：breviilin a药物可以通过降低线虫肠道内的细菌负荷，提升其对病原菌的抵抗能力，以此来够增强宿主天然免疫，疗效明确，原理清楚，说明该药物在本发明特定条件下具有显著增强宿主天然免疫的效果，有很好的临床应用前景。