抗体及其制备方法与流程

本发明涉及抗体、预测变体抗体的序列的方法以及其制备方法。本发明更具体地涉及针对人表皮生长因子受体(egfr)的变体抗体。

背景技术：

0、发明背景

1、抗体已经成为一类主要的生物治疗剂(aggarwal，2014)，但是尽管历史悠久并且市场占有率高，新抗体的开发者仍然面临许多挑战(lu等人，2012)。一个这样的问题是免疫原性风险，其中抗生物治疗性抗体应答可降低治疗功效并表现出一系列其他有害副作用(jawa等人，2013；pendley等人，2003；roskos等人，2004；schellekens，2002；swann等人，2008)。这一问题已经部分地、但并非完全地(harding等人，2010；hwang和foote，2005)通过建立明确定义的人源化方法(baca等人，1997；dall’acqua等人，2005；dennis，2010；gonzales等人，2004；jones等人，1986；khee hwang等人，2005；lazar等人，2007；osbourn等人，2005；roguska等人，1994)和“完全人”抗体的出现(duvall等人，2011；feldhaus等人，2003；lee等人，2014；li等人，2006；lonberg，2008；mccafferty等人，1990)来解决。稳定性是治疗性抗体“可开发性”的另一个决定因素(jarasch等人，2015)，因为结构完整性的丧失会降低结合活性，导致聚集并且通常破坏治疗潜力(frokjaer和otzen，2005；hermeling等人，2004)。生物治疗性聚集和免疫原性通常是相关的，因为由于热稳定性差或其他因素导致的蛋白质聚集体可加剧经典抗药物抗体应答并通过非经典途径产生有害应答(ratanji等人，2013；rosenberg，2006)。

2、尽管完全人抗体技术的加速增长，但动物模型的免疫、随后抗体克隆和人源化是简单、方便且广泛使用的(nelson等人，2010)。通过互补决定区(cdr)移植进行人源化是一种常见策略。遗憾的是，cdr移植经常导致热稳定性和结合亲和力的显著降低，从而需要反向取代非人残基以减轻功能损失(clark，2000)。因此，人源化抗体的成功工程化需要同时考虑多个目标：人性、热稳定性和结合亲和力。

技术实现思路

1、本发明部分基于变体西妥昔单抗序列的开发。本发明中的变体显示出增强的热稳定性(达到6℃的较高熔点)和显著改进的人性，即它们比起始或亲本西妥昔单抗抗体更紧密地类似于重链和/或轻链基因的种系形式。此外，结合亲和力接近或甚至优于亲本抗体的结合亲和力(达到高1.5倍的kd)。

2、在一个方面，本发明提供了一种分离的变体西妥昔单抗抗体单克隆抗体或其抗原结合部分。所述抗体或抗原结合片段包含重链和/或轻链。所述重链和/或轻链在序列上相较于对应物西妥昔单抗多肽(例如，包含seq id no:1或seq id no:2的多肽)与种系egfr抗体序列更相似。

3、在另一个方面，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。所述抗体或其抗原结合部分，所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链比包含seq id no:1和seq id no:2的相应分离的单克隆抗体或其抗原结合部分热稳定性更高。

4、在另一方面，本发明提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链和/或轻链在序列方面相较于包含seq id no:1或seq id no:2的对应物多肽与种系egfr抗体序列更相似并且也比包含seq id no:1或seq id no:2的相应分离的单克隆抗体或其抗原结合部分热稳定性更高。

5、在一些实施方案中，所述重链或轻链在序列方面相较于seq id no:1或seq idno:2与种系egfr抗体序列(例如，选自由seq id no:19-22和23组成的组的种系抗体序列)更相似。在一些实施方案中，所述重链或轻链序列包含表1中公开的序列。

6、在一些实施方案中，所述分离的单克隆抗体还包含选自由seq id no:13、seq idno:14和seq id no:15组成的组的重链cdr1(hcdr1)区。

7、在一些实施方案中，所述分离的单克隆抗体还包含选自由seq id no:16、seq idno:17和seq id no:18组成的组的轻链cdr1(lcdr1)区。

8、在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸序列，其编码变体西妥昔单抗单克隆抗体。所述核酸序列可编码重链抗体、轻链抗体或两者。

9、本发明还提供了一种重组表达载体，其包含编码变体西妥昔单抗单克隆抗体的分离的核酸序列。

10、在另一个方面，本发明包括一种重组表达宿主细胞，其包含编码变体西妥昔单抗单克隆抗体的核酸序列，例如具有变体西妥昔单抗单克隆抗体编码序列的重组表达载体。宿主细胞可包含编码重链变体西妥昔单抗多肽的核酸序列、编码轻链变体西妥昔单抗多肽的核酸序列、或重链和轻链变体西妥昔单抗多肽两者。

11、在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含变体西妥昔单抗抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

12、在另一方面，本发明提供了一种治疗egfr相关疾病或病症的方法。所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含变体西妥昔单抗抗体或其抗原结合部分的药物组合物。

13、在一些实施方案中，所述egfr相关疾病或病症是表达egfr的癌症或肿瘤。所述癌症或肿瘤可以是例如成胶质细胞瘤、导管或导管内乳腺癌、非小细胞鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌或头颈部鳞状细胞癌。

14、在一些实施方案中，所述疾病或病症是炎性或自身免疫性疾病或病症，例如，慢性阻塞性肺病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、内脏动脉闭塞性休克、脊髓损伤、1型糖尿病或多发性硬化症。

15、在一些实施方案中，所述药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用。另外的治疗剂可以是例如，il-18拮抗剂、il-12拮抗剂、tnf拮抗剂、甲氨蝶呤、皮质类固醇、环孢菌素、雷帕霉素、fk506和/或非类固醇抗炎剂。

16、另外的一种或多种剂可与变体西妥昔单抗抗体药物组合物同时施用或在单独的时间施用。

17、本发明还提供了一种制备变体西妥昔单抗抗体的方法。所述方法包括在允许变体西妥昔单抗抗体的表达和功能的条件下培养细胞。在一些实施方案中，所述方法包括纯化所表达的变体西妥昔单抗抗体。

18、除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管可在本发明的实践或测试中使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了合适的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式整体并入。在冲突的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的而非意图具有限制性。

19、根据以下详细描述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。