一种抗菌肽CECTm及其制备与应用

本发明属于基因工程，具体涉及抗菌肽制备大，更具体的涉及一种抗菌肽cectm及其制备与应用的。

背景技术：

1、抗菌肽是一类可诱导的、小分子量、热稳定性、具有广谱抗菌活性的可溶性多肽，抗菌肽不仅对一些革兰氏阳性菌及阴性菌有很高的抗菌活力，尤其是对耐药菌株有明显抑杀作用，如能杀死抗多种抗生素的致病性的乙酸钙不动杆菌，更为重要的是抗菌肽仅作用于原核细胞及发生病变的真核细胞，对真核细胞几乎没有作用，对高等动物机体正常细胞无损伤，这可能与细胞膜和骨架上的组成有关。对真菌、原虫、肿瘤细胞及病毒亦有抑杀作用。抗菌肽作用机制独特，无致畸变作用，无蓄积毒性，还不容易产生抗药性在面临抗药性和筛选新的抗生素极端困难的情况下，昆虫抗菌肽可能成为抗生素的新来源，可望成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物。

2、近年来，对抗菌肽的研究越来越重视。一方面在分子水平上研究抗菌肽在生物免疫防御系统中精细的合成过程及其调控机制；另一方面，也是更重要的方面，研究抗菌肽的开发应用价值，使之成为继青霉素等传统抗生素之后又一类重要的新型抗菌药物，为解决细菌对青霉素等传统抗生素日益增强的耐药性这一棘手的难题提供新思路。

3、科学界20多年围绕着抗菌肽的发现、抑菌机制和对哺乳动物的安全性等方面进行了大量的研究，发现抗菌肽在抑制病原菌、中和细菌毒素、调节肠道免疫、改善肠道健康和促进动物生长方面具有明确的作用，抗菌肽难产生耐药性且无残留，可广泛应用于畜牧业生产中。尤其是在2020年7月1日，饲料禁抗政策正式实施，我国饲料禁抗新时代来临，从抗菌肽活性和性价比来看，抗菌肽是一款优秀的替抗产品。

4、目前抗菌肽的生产方式主要有三种：天然提取、化学合成和生物工程发酵。天然抗菌肽主要来自动植物，含量极低，提取过程复杂，化学合成方法高昂，每公斤成本上千万人民币，不适合工业化生产，无法广泛普及应用。此外，大部分抗菌肽稳定性还不够理想，大规模生产的主要限制条件之一就是成本问题。

技术实现思路

1、针对现有技术中大部分抗菌肽稳定性不够理想，成本较高，大规模生产的受限的技术现状，本技术旨在提供一种抗菌肽cectm、及其制备与应用，本发明针对抗菌肽的活性、稳定性、成本问题，设计合成了新的抗菌肽基因，转化假单胞菌，诱导表达后，其多肽的二级结构具有α-螺旋结构，带有正电荷，热稳定性强，抗菌谱广，并且通过优化培养条件获得抗菌肽的平均效价是352.5au/ml，是优化前效价(142.06au/ml)的2.48倍。本技术所提供的抗菌肽能够为抗菌肽在农业、畜牧业、医疗卫生等方面的应用奠定基础。

2、本发明通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供一种抗菌肽cectm，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、所述的抗菌肽cectm，编码所述抗菌肽cectm的核苷酸序列如seq.id.no.2所示。

5、进一步的，本发明还提供抗菌肽cectm的制备方法，所述制备方法，采用如下步骤制备获得：

6、(1)人工合成n端含有ecori接头、c端含有hind iii接头的cectm基因片段，用限制性内切酶ecori和hind iii双酶切cectm基因片段，形成粘性末端；

7、(2)采用ddh2o25μl，10×buffer5μl，cectm15μl，ecori 2.5μl，hind iii 2.5μl，反应体系，37℃恒温，孵育4-6h；

8、(3)使用限制性内切酶ecori和hind iii双酶切pet32a质粒载体，ddh2o 11μl，10×buffer 2μl，pet32a 5μl，ecori 1μl，noti 1μl反应体系，37℃恒温，孵育4-6h；

9、(4)将步骤(3)中双酶切后的pet32a和步骤(2)中获得的cectm片段，经t4dna连接酶在4℃连接过夜，连接产物pet32a-cectm转化e.coli dh5α感受态细胞，抗生素筛选，挑取阳性克隆进行菌液pcr鉴定、测序鉴定；

10、(5)采用ddh2o 25μl；10×buffer 5μl；步骤(4)中构建成功获得的pet32a-cectm15μl；ecori 2.5μl；noti 2.5μl；37℃恒温，孵育4-6h，切下cectm基因；

11、(6)采用ddh2o 11μl；10×buffer2μl；pgapzαc 5μl；ecori 1μl；noti 1μl；37℃恒温，孵育4-6h切pgapzαc；

12、(7)将步骤(6)及步骤(5)中双酶切后的pgapzαc和cectm片段，经t4dna连接酶在4℃连接过夜，获得的连接产物pgapzαc-cectm转化e.coli top10感受态细胞，抗生素筛选，挑取阳性克隆进行菌液pcr鉴定、测序鉴定；

13、(8)将步骤(7)中的pgapzαc-cectm用bglii酶切切线性化后，采用锂盐法(licl)，转化假单胞杆菌细胞，涂布在含有50-150g/ml博来霉素的ypd平板上，28-30℃孵育2-3天；

14、(9)清洗锥形瓶、摇菌管等所需器皿，121℃灭菌20min，70℃烘干备用；将ypd液体培养基分装于100ml摇菌管中，每支试管5ml，并加入博来霉素10μl。将步骤(8)中平板上生长的细菌用灭菌牙签轻轻挑起，接种于摇菌管中28-30℃，150-200rpm培养；

15、(10)选取步骤(9)中获得的将1ml菌种接种于含有100ml培养基的锥形瓶中，28-30℃，150-200rpm培养4h-6h，测od600值，od600处于0.6-0.8之间时，28-30℃，150rpm继续培养4-8h，即可分离获得抗菌肽cectm。

16、更进一步的，本发明还提供一种用于制备抗菌肽cectm的发酵培养基，所述发酵培养基中的碳源为5g/l-50g/l葡萄糖。

17、更进一步的，本发明还提供一种用于制备抗菌肽cectm的发酵培养基，所述发酵培养基中的氮源为0.5g/l-20g/l硫酸铵。

18、更进一步的，本发明还提供一种用于制备抗菌肽cectm的发酵培养基，所述发酵培养基中的无机盐为10g/l-20g/l na2hpo4·10h2o、5g/l-15g/l kh2po4、0.01g/l-0.1g/lcacl2、0.25g/l-1g/l mgso4。

19、优选的，所述的用于制备抗菌肽cectm的发酵培养基的组成为：葡萄糖40g/l、(nh4)2so42.69g/l、kh2po45.73g/l、na2hpo4·10h2o 13.51g/l和cacl20.01g/l、mgso40.25g/l，余量是水。

20、更进一步的，本发明还提供所述抗菌肽cectm或抗菌肽cectm制备方法制备获得的抗菌肽cectm在饲料添加剂、抗菌药物制剂、保健品、防腐剂中的应用。

21、通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果:

22、本发明公开了一种抗菌肽cectm及其制备与应用，针对编码抗菌肽cectm的核苷酸seq id no.1所示，针对抗菌肽cectm的氨基酸如seq id no.2所示，将融合抗菌肽cectm基因亚克隆至质粒pgapzαc上，用bglii酶切使之线性化，采用licl或电转法转化假单胞菌。转化子经锥形瓶发酵表达获得抗菌肽。并提供了最佳发酵培养基配方。通过本技术提供的融合抗菌肽cectm多肽的二级结构具有α-螺旋结构，带有正电荷，热稳定性强，抗菌谱广，能够杀灭革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，优化后的抗菌肽的平均效价是352.5au/ml，是优化前效价(142.06au/ml)的2.48倍。本技术所提供的抗菌肽cectm能够为在农业、畜牧业、医疗卫生等方面的应用奠定基础。