适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法及其应用与流程

1.本发明涉及原位杂交领域，具体涉及一种适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法及其应用。


背景技术：

2.从1975年第一代测序技术的发明到2005年起二代测序技术的兴起，核酸测序获得的海量数据推动了生命科学的高速发展。而对核酸的检测方法也不断进步，单细胞测序技术的发明实现了在单个细胞水平上对转录组或基因组进行扩增并测序，但是难以获取核酸分子在空间位置上的分布信息。研究表明，核酸分子在组织和细胞的空间分布与功能紧密联系，在空间水平检测核酸分子具有重要意义。
3.目前主流的原位空间组学检测方法有单分子荧光原位杂交(smfish)、序贯荧光原位杂交(seqfish)、杂交链式反应(hcr)以及starmap(spatially-resolved transcript amplicon readout mapping)等。但目前的方法仍然存在下列问题：
4.1.smfish被认为是核酸检测的行业标准，其原理是直接使用荧光标记的探针对rna进行原位杂交。该类方法的成像需要针对每个基因设计至少24个荧光探针，而且由于未对信号进行放大，其检测需要借助于超分辨荧光显微镜，对技术要求和成均有较高要求，此外此类方法难以进行高通量检测。
5.2.seqfish技术的技术特点是通过对基因预先进行n位的编码，随后在1～n轮杂交过程中呈现每个基因的1～n轮编码，进一步识别不同的核酸分子。该方法具有通量高、检测效率高的优点，但是与smfish类似，该方法也需要借助超分辨显微镜，且需要繁琐的多轮杂交和成像，成本相对较高。
6.3.starmap运用锁式探针对核酸分子结合，然后通过滚环扩增的方式对杂交的信号进行放大，进一步用原位测序的方法来展示空间转录组，通过连接测序的方式对探针序列进行解读。该方法的优势是检测通量高、信号强度高，可运用普通共聚焦进行成像，但是该方法相对基于杂交的检测方法而言效率较低，通过连接测序的方法耗时较长。


技术实现要素：

7.本发明针对现有技术显微镜单次只能分辨有限的标记种类(y种)，而传统方法通过标记探针逐轮检测在n轮以后只能识别y
×
n种核酸分子，连接测序耗时长和直接杂交信号强度低的缺陷，提供了一种适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，本发明兼顾技术难度、检测成本和检测通量，基于滚环扩增(rca)放大信号，通过在y
×
n种次级探针中选取不重复的m种作为一个组合用以标记一类核酸分子，进行n轮的荧光探针与靶基因杂交，解读每个组合m种标记的共定位(即一类核酸分子)，进一步可以确定空间上不同种类核酸分子的分布，该方法可通过n轮的杂交，达到了同时检测最多种核酸分子的目的，且信号强度高，信号的解读不依赖超分辨成像平台，实现了检测成本、检测轮数、检测通量和信号强度之间的平衡，推动了原位空间转录组的普及和发展。
8.为实现上述目的，本发明所设计一种适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，包括以下步骤：
9.1)初级杂交探针的设计
10.从待检测细胞或组织的核酸序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无rna高级结构的靶序列区域，并将设计出初级杂交探针，其中，所述初级杂交探针由锁式探针和rca引发探针组成；
11.2)次级杂交探针(次级杂交探针为携带特殊标记的脱氧核糖核酸序列)的设计
12.根据待检测细胞或组织的核酸种类数，设计y
×
n条次级杂交探针，所述次级杂交探针与初级杂交探针中的锁式探针的部分区域互补连接；其中，y
×
n数值需满足待检测细胞或组织的核酸种类数，
13.y为每轮杂交使用的次级杂交探针个数，y数值由显微镜单次分辨的最多标记个数决定；
14.n为杂交轮数；
15.m为用以标记一种核酸分子所使用的次级探针种类数；
16.3)初级杂交探针预处理
17.对初级杂交探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理，随后与rca引发探针结合，构成初级杂交探针；
18.4)初级探针杂交
19.在待检测样本切片上制备一个反应腔室，依次进行固定、脱水和透化处理，再将含有初级杂交探针的溶液加入到反应腔室中进行杂交反应；
20.5)连接反应
21.加入连接酶反应体系，进行连接反应，使锁式探针形成闭合的环状结构；
22.6)滚环扩增
23.使用phi29 dna聚合酶以rca引发探针为引物，以锁式探针的环状结构为模板进行滚环扩增，形成大量重复的核酸序列供次级杂交探针结合；
24.7)次级杂交探针杂交
25.次级探针的杂交分为n轮，每轮使用y种带有不同标记的次级杂交探针与杂交缓冲液混合后加入反应腔室中进行杂交反应，进行下一轮杂交前使用洗涤液洗去组织中前一轮的次级杂交探针；
26.8)信号解读
27.在每一轮杂交结束后对待测样本进行成像以检测次级杂交探针所携带的标记，通过n轮杂交和成像，根据预先设计的标记组合确定每一个信号点代表的检测核酸，进而确定核酸分子在空间中的位置。
28.进一步地，所述步骤1)中，待检测核酸序列的靶序列由3段连续的靶序列a、b和d组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为a’序列，c序列和b’序列，所述a’序列和b’序列分别与靶序列a、靶序列b互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；所述c序列由m个barcode序列组成且分别与相应的次级探针序列相同；其中，m为用以标记一种核酸分子所使用的次级探针种类数；rca引发探针由d’序列和e序列组成，所述d’序列与待检测核酸序列的d序列互补，e序列与锁式探针部分互补。
29.再进一步地，所述barcode序列之间由1个或多个碱基间隔开。
30.再进一步地，所述步骤2)中，次级杂交探针为携带特殊标记的脱氧核糖核酸序列；且次级杂交探针的长度为10-20个碱基；
31.每条次级探针的核酸序列相互之间的碱基排列各不相同。
32.再进一步地，所述步骤2)中，特殊标记为荧光标记、抗体标记、生物素标记、地高辛标记和特定蛋白标记中任意一种或多种，每轮杂交中的y种次级探针所携带的特殊标记各不相同且在显微镜单次成像中可被区分。
33.再进一步地，所述步骤3)中，磷酸化处理过程中，使用的酶为t4d多聚核苷酸激酶t4(t4 pnk酶)。
34.再进一步地，所述步骤5)中，连接酶为splint r连接酶。
35.再进一步地，所述步骤7)中，使用m类探针标记一种核酸分子。
36.本发明还提供了一种上述的方法在鉴定不同基因在细胞和组织内表达位置中的应用。
37.本发明的有益效果：
38.本发明通过组合标记来检测核酸探针，可以在有限的杂交轮数提高检测通量，且操作简单，信号强度高，仅使用普通共聚焦显微镜便可实现单分子分辨率的检测精度，实现了检测成本、检测轮数、检测通量和信号强度之间的平衡，推动了原位空间转录组的普及和发展。
39.本发明通过简单鉴定不同基因在细胞和组织内表达位置，能够用于肿瘤诊断中多种肿瘤标志物的靶向检测；用于与基因表达紊乱相关疾病的诊断与机理研究、基因功能的研究和用于鉴定不同类型细胞的空间分布(如在单细胞转录组测序后鉴定各个细胞类群的位置)。
附图说明
40.图1为本发明中基因的编码和解码示意图；
41.图2为本发明中初级探针杂交原理图；
42.图3为本发明中次级探针杂交原理图；
43.图4为实施例1中原位检测6个基因在小鼠脑穹隆下器的结果图；
44.图5为实施例2中19个基因在小鼠脑皮层中原位检测的结果图；
具体实施方式
45.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
46.实施例1
47.利用上述检测核酸空间位置分布的方法检测小鼠穹隆下器6个基因原位空间转录组，包括以下步骤：
48.1.次级杂交探针的设计
49.用2种荧光探针来标记1类核酸分子，设计4种携带不同荧光的次级探针，进行1轮杂交检测6种核酸。
50.2.初级杂交探针的设计
51.所选基因为小鼠slc32a1、slc17a6、mag、flt1、ntsr2、fcer1g，针对这些rna的靶序列设计对应的锁式探针及rca探针，探针序列如下：
52.53.[0054][0055]
3.探针预处理
[0056]
使用t4 pnk酶反应体系对锁式探针进行磷酸化处理。
[0057]
4.样品预处理
[0058]
将组织进行冰冻切片获得厚度10μm的小鼠脑片，根据样品大小贴上反应腔室；pbst快速洗2次，4％多聚甲醛(pfa)对脑组织固定10分钟，将反应腔室内溶液吸弃；用pbst洗涤3次，每次5min，加入-20℃预冷的甲醇，立即放入-80℃反应15分钟；将反应腔室从-80℃取出，然后置于室温平衡5分钟，将反应体系吸弃，用pbst洗涤3次，每次5分钟。
[0059]
5.初级探针杂交
[0060]
将杂交探针以100nm的终浓度加入到杂交缓冲液中，将杂交反应体系混匀后加入反应腔室中，置于湿盒内，37℃过夜杂交。
[0061]
6.连接反应
[0062]
将连接酶反应体系加入到反应腔室内，置于25℃反应2小时。
[0063]
7.滚环扩增
[0064]
将phi29 dna聚合酶滚环扩增反应体系加入到反应腔室内，置于30℃反应2小时。
[0065]
8.次级探针杂交
[0066]
将4种带有不同荧光标记的探针与杂交缓冲液混合后加入反应腔室中，室温反应1小时；
[0067]
次级探针序列如下：
[0068][0069][0070]
9.信号解读
[0071]
应用leica tcs sp8激光共聚焦进行成像，分别设置对应荧光通道，确定组织切片的信号最顶端和最底端，以0.6μm的步径对组织进行逐层扫描，获得荧光信号在空间中的位置分布图，当两个不同的荧光信号在同一个位置时，这两个信号标记一个rna分子，根据预先设计的荧光标记组合确定待测rna在小鼠脑组织中的位置分布，叠加各层图像获得最大投影的整体信号图，结果如图4所示。每个基因表达出的rna所使用的荧光组合如下：
[0072]
ꢀꢀ
基因名称第一轮荧光组合slc32a1aleax fluor 488，aleax fluor 546slc17a6aleax fluor 546，aleax fluor 647magaleax fluor 488，aleax fluor 594flt1aleax fluor 488，aleax fluor 647ntsr2aleax fluor 594，aleax fluor 647fcer1galeax fluor 546，aleax fluor 594
[0073]
实施例2
[0074]
利用上述检测核酸空间位置分布的方法检测小鼠皮层19个基因原位空间转录组，包括以下步骤：
[0075]
1.次级杂交探针的设计
[0076]
用2种荧光探针来标记1类核酸分子，设计8种携带不同荧光的次级探针，进行2轮杂交检测19种核酸。
[0077]
2.初级杂交探针的设计
[0078]
所选基因为小鼠ctss、cx3cr1、ntsr2、gjb6、acta2、abcc9、vtn、flt1、pecam1、tmem212、ak7、ptgds、mbp、slc17a6、slc17a7、slc17a8、gad1、gad2、slc32a1，针对这些基因转录出的rna靶序列设计对应的锁式探针及rca探针，探针序列如下：
[0079]
[0080]
[0081]
[0082][0083]
3.探针预处理
[0084]
使用t4 pnk酶反应体系对锁式探针进行磷酸化处理。
[0085]
4.样品预处理
[0086]
将组织进行冰冻切片获得厚度10μm的小鼠脑片，根据样品大小贴上反应腔室；pbst快速洗2次，4％多聚甲醛(pfa)对脑组织固定10分钟，将反应腔室内溶液吸弃；用pbst洗涤3次，每次5分钟，加入-20℃预冷的甲醇，立即放入-80℃反应15分钟；将反应腔室从-80℃取出，然后置于室温平衡5分钟，将反应体系吸弃，用pbst洗涤3次，每次5分钟。
[0087]
5.初级探针杂交
[0088]
将杂交探针以100nm的终浓度加入到杂交缓冲液中，将杂交反应体系混匀后加入反应腔室中，置于湿盒内，37℃过夜杂交。
[0089]
6.连接反应
[0090]
将连接酶反应体系加入到反应腔室内，置于25℃反应2小时。
[0091]
7.滚环扩增
[0092]
将phi29 dna聚合酶滚环扩增反应体系加入到反应腔室内，置于30℃反应2小时。
[0093]
8.第一轮次级探针杂交
[0094]
将4种带有不同荧光标记的探针与杂交缓冲液混合后加入反应腔室中，室温反应1
小时。
[0095]
第一轮次级探针序列如下：
[0096]
探针名称核酸序列荧光基团c-488accatgctggatctagaleax fluor 488c-546tactagctcgattcaaaleax fluor 546c-594taggcatgaacgtcgaaleax fluor 594c-647cgtagcttacctgcaaaleax fluor 647
[0097]
9.第一轮成像
[0098]
应用leica tcs sp8激光共聚焦进行成像，分别设置对应荧光通道，确定组织切片的信号最顶端和最底端，以0.6μm的步径对组织进行逐层扫描，获得荧光信号在小鼠脑组织中的位置分布图，用60％的去离子甲酰胺溶液在40℃洗1分钟以除去第一轮荧光探针。
[0099]
10.第二轮次级探针杂交
[0100]
将另外4种带有不同荧光标记的探针与杂交缓冲液混合后加入反应腔室中，室温反应1小时。
[0101]
第二轮次级探针序列如下：
[0102]
探针名称核酸序列荧光基团b-488tatgtgaccgggtacaaleax fluor 488b-546gtctattagtggagccaleax fluor 546b-594ataacgatccctcacaaleax fluor 594b-647tacccgagatagagtcaleax fluor 647
[0103]
11.第二轮成像
[0104]
应用leica tcs sp8激光共聚焦进行成像，成像区域与第一轮成像相同，分别设置对应荧光通道，确定组织切片的信号最顶端和最底端，以0.6μm的步径对组织进行逐层扫描，获得荧光信号在小鼠脑组织中的位置分布图。
[0105]
12.信号解读
[0106]
对3轮图片进行配准，将两轮的荧光信号叠加在一起。当两个不同的荧光信号在同一个位置时，这两个信号标记一个rna分子，根据预先设计的荧光标记组合确定待测rna在空间中的位置分布。叠加各层图像获得最大投影的整体信号图，结果如图5所示。每个基因表达出的rna所使用的荧光组合如下：
[0107]
基因第一轮荧光标记第二轮荧光标记ctssaleax fluor 647aleax fluor 488cx3cr1aleax fluor 594，aleax fluor 647 ntsr2aleax fluor 647aleax fluor 594gjb6aleax fluor 488，aleax fluor 546 acta2 aleax fluor 488，aleax fluor 647abcc9 aleax fluor 594，aleax fluor 647vtnaleax fluor 594aleax fluor 488flt1aleax fluor 488，aleax fluor 594 pecam1aleax fluor 488aleax fluor 546
tmem212aleax fluor 488，aleax fluor 594 ak7aleax fluor 546aleax fluor 647ptgdsaleax fluor 488，aleax fluor 647 mbpaleax fluor 488aleax fluor 594slc17a6aleax fluor 546，aleax fluor 647 slc17a7 aleax fluor 488，aleax fluor 546slc17a8aleax fluor 488aleax fluor 647gad1 aleax fluor 546，aleax fluor 594gad2aleax fluor 546，aleax fluor 594 slc32a1 aleax fluor 546，aleax fluor 647
[0108]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。