一种奶山羊Zfy基因干扰片段与一种表达载体及其应用

一种奶山羊zfy基因干扰片段与一种表达载体及其应用
技术领域
1.本发明涉及动物繁殖学技术领域，尤其涉及一种奶山羊zfy基因干扰片段与一种表达载体及其应用。


背景技术：

2.动物的性别控制(sex control)是指通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。动物性别控制的意义重大，主要在于：(1)提高畜牧业生产效益；(2)生产具有利用价值的性别的动物(一般雌性动物的利用价值要高于雄性动物)；(3)避免胚胎移植过程中异性胚胎导致的孪生不育；(4)提高选种强度；(5)预防伴性遗传病的发生等。
3.对动物性别控制的相关研究早在多年前就已经开始。目前国内外家畜进行性别控制的方法主要有三种:(1)分离x精子与y精子。通过x、y精子微弱的生物学差异，分离出含两种不同染色体的精子，目前主要采用物理分离法，如采用流式细胞分离仪分离精子的准确率可达到90％，但其分离速度太慢(18mil-lion/h)，且精液价格昂贵，分离后精液不耐冷冻，精子死亡率较高，因而在生产应用上受到限制；(2)胚胎的性别鉴定。胚胎性别鉴定主要是通过鉴定胚胎的性别，从而人工干预出生的性别比例。早期胚胎性别鉴定方法主要有细胞学方法、免疫学方法、分子生物学方法、pcr扩增法、雄性特异性dna探针法等，但从胚胎上切取部分细胞而后经冷冻、解冻会对胚胎造成一定的损害使胚胎移植的成功率下降，同时劣质胚胎的性别鉴定成功率更低，这就制约了提供预知性别家畜胚胎的商业化进程；(3)控制家畜受精的外部环境。家畜外部环境中的某些因素也是性别决定机制的重要条件，主要包括营养、体液酸碱度、温度、输精时间、年龄胎次、激素水平等。但决定动物性别的因素主要是动物体的内部因素，采用控制外部环境的方法来控制出生动物性别，随机性大，不稳定，且不易控制。如今，随着科学技术水平的发展，从基因水平研究性别控制已经成为一种新的方向，同时随着基因技术的日趋成熟，基因技术的成本也大幅下降，使其在生产应用中大规模推广成为了一种可能。
4.rna干扰(rnainterference)是一种转录后水平的基因沉默现象，是通过体外人工合成双链rna或体内的双链rna在细胞内特异性降解其同源mrna，使相应的基因沉默，达到阻止基因表达的目的，并非转基因，且具有特异、高效、易于操作等优点。
5.zfy基因位于哺乳动物y染色体上，负责编码一个大的酸性链锌指蛋白上的12～13个转录因子的特异性基因。zfy基因具有特定的核定位信号区域和dna结合位点，能够特异性的与靶基因结合，定向引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，其编码蛋白作为转录调控因子，与y精子的发育相关。通过rna干扰技术，沉默zfy基因是实现性别控制的可行途径。但是现有技术通过沉默zfy基因能够实现性别控制的动物并不包括奶山羊。因此为了提高奶山羊的利用效率研究一种利用沉默zfy基因实现控制奶山羊性别的方法势在必行。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种奶山羊zfy基因干扰片段与一种表达载体及其应用。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种奶山羊zfy基因干扰片段，所述奶山羊zfy基因干扰片段的序列如seq id no.1～2所示。
9.本发明还提供了所述的奶山羊zfy基因干扰片段在制备用于沉默奶山羊精子细胞中的zfy基因的制剂中的应用。
10.本发明还提供了所述的奶山羊zfy基因干扰片段在制备用于控制奶山羊性别的药剂中的应用。
11.本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包括所述的奶山羊zfy基因干扰片段以及空载载体。
12.作为优选，所述空载载体为pgpu6/gfp/neo。
13.本发明还提供了所述的表达载体在制备用于沉默奶山羊精子细胞中的zfy基因的制剂中的应用。
14.本发明还提供了所述的表达载体在制备用于控制奶山羊性别的药剂中的应用。
15.本发明提供了一种奶山羊zfy基因干扰片段与一种表达载体及其应用。本发明提供的rna干扰片段，对奶山羊zfy基因的表达进行人为干扰，使y精子的生成和发育受阻，活力下降，但是对x精子的发育和活力没有影响，从而为x精子创造更多的受精机会，使子一代的母羔比例增加。本发明在受精前有效控制了后代性别，达到了控制后代奶山羊性别的目的，而且成本低廉、使用方便。为奶山羊的进一步应用提供理论基础。
附图说明
16.图1为pgpu6/gfp/neo空载载体图谱。
17.图2为生精细胞中zfy/zfx基因mrna表达水平。
具体实施方式
18.本发明提供了一种奶山羊zfy基因干扰片段，所述奶山羊zfy基因干扰片段的序列如seq id no.1～2所示。
19.在本发明中，所述奶山羊zfy基因干扰片段的正义链的序列如seq id no.1所示，具体为5'-caccgtgctcagatatcttagaattcaagagattctaagatatctgagcacttttttg-3'；反义链的序列如seq id no.2所示，具体为5'-gatccaaaaaagtgctcagatatcttagaatctcttgaattctaagatatctgagcac-3'。
20.在本发明中，所述奶山羊zfy基因干扰片段为一个短发夹rna(shrna)，shrna的dna模板中的loop结构的核苷酸序列为ttcaagaga以避免形成终止信号，shrna的转录终止序列采用t6结构。正义链模板的5’端的核苷酸序列为cacc，与bbsi酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端的核苷酸序列为gatc，与bamhi酶切后形成的粘端互补。
21.在本发明中，所述shrna是在sirna片段的基础上进行构建得到的。如果sirna的第一个碱基不是g，则在cacc后补加一个g。对每个sirna片段的5’和3’添加酶切位点，loop环及终止序列。
22.本发明还提供了所述的奶山羊zfy基因干扰片段在制备用于沉默奶山羊精子细胞中的zfy基因的制剂中的应用。
23.本发明还提供了所述的奶山羊zfy基因干扰片段在制备用于控制奶山羊性别的药剂中的应用。
24.本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包括所述的奶山羊zfy基因干扰片段以及空载载体。
25.在本发明中，所述空载载体为pgpu6/gfp/neo。
26.本发明还提供了所述的表达载体在制备用于沉默奶山羊精子细胞中的zfy基因的制剂中的应用。
27.本发明还提供了所述的表达载体在制备用于控制奶山羊性别的药剂中的应用。
28.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
29.实施例1
30.构建奶山羊zfy基因的干扰片段和表达载体
31.本技术经过前期以奶山羊zfy基因(ncbi登录号为：xm_018044894.1)为模板设计引物，扩增得到1165bp的序列。通过sirna设计软件对1165bp的序列进行设计，通过对奶山羊生精细胞培养，细胞转染，实时荧光定量，筛选出了2对sirna片段，sirna片段的cdna模板如seq id no.5～6所示。
32.所述1165bp的zfy基因序列如seq id no.13所示，seq id no.13为ttttgatggaataggaactgatgctacacacatggatggtgatcaaattgttgtggaagtacaagaaactgtttttgtttcagatgttgtggattcagatataactgtgcataattttgttcctgatgatccagactcagttgtaatccaagatgttattgagaatgttgttattgaggatgttcagtgctcagatatcttagaa gaagcagatgtgtctgaaaatgtcatcattcctgagcaaatgctttcctcagatgtaacagaagaagtgtctttagcacattgcacagtcccagatgacgtcttagcttctgatattacttcagcctcaatgtctatgccagaacatgtcttgaccagtgagtctgtacatgtgtctgatgttggacatgttgaacacattgttcgtggtagtgtagtagaggcagaaattgtcactgatcctctgacagacgacgtagtgtcagaagaagtattggtagcagattgtgcctcagaagcagtcatagatgccaacgggatccctgtggaccagcaggatgatgacaaaggcaactgtgaggactaccttatgatttccttggatgatgatggcaaaattgaacaggactgttctgctggtatgaccatagacagagagtcggaaattgatccttgtaaggtggatggcacttgccctgaagtcatcaaggtgtatatttttaaagctgaccctggagaggatgacttaggtgggactgttgacattgtggagagtgagcctgagaatgatcatggagttgaactccttgatcagagtaacagtattcgtatgccaagggaaaagatggtttatatgactgtcagtgactctcaacaagaagatgaagatttaaatgttgctgaaattgcagatgaagtttatatggaagtgattgtaggagaggaagatgctgctgttgctgcagcagctgctaccactgttcatgaacaggaaatggatgacagtgaaatcaaaaccttcatgccaatagcatgggcagcagcttatggtaataattctgatggaattgaaaatcggaatggcactgcaagtgctctcttgcacatagatgagtctgctggacttggcagactggctaaacaaaagccaaagaaaaggagaagacctgattccaggcag。
33.seq id no.5为5’gtgctcagatatcttagaa3’；
34.seq id no.6为5’atgccagaacatgtcttga3’。
35.对sirna片段的5’和3’添加酶切位点，loop环及终止序列。loop环结构选用了ttcaagaga，终止序列采用t6结构。最终得到的形式为t+正义链19nt靶序列+茎环结构
(cttgaaaga)+靶序列反向互补序列+rna polyiii聚合酶转录中止位点(tttttt)+xhoi酶切位点(gagct)的shrna寡核苷酸序列，shrna寡核苷酸序列即为奶山羊zfy基因的干扰片段。具体的shrna正义链模板的5’端添加了cacc，与bbsi酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了gatc，与bamhi酶切后形成的粘端互补。委托上海吉玛制药技术有限公司合成该shrna寡核苷酸序列。合成的shrna片段经退火合为双链，按照seq id no.5所示的片段合成得到的shrna寡核苷酸的名称为pgpu6-2，具体的序列如seq id no.1～2所示。按照seq id no.6所示的片段合成得到的shrna寡核苷酸的名称为pgpu6-1，具体的序列如seq id no.3～4所示。
36.seq id no.1为5'-caccgtgctcagatatcttagaattcaagagattctaagatatctgagcacttttttg-3'；
37.seq id no.2为5'-gatccaaaaaagtgctcagatatcttagaatctcttgaattctaagatatctgagcac-3'；
38.seq id no.3为5'-caccatgccagaacatgtcttgattcaagagaagacatttctttactatgcttttttg-3'；
39.seq id no.4为5'-gatccaaaaaaatgccagaacatgtcttgatctcttgaaagacatttctttactatgc-3'。
40.将上述得到的pgpu6-1和pgpu6-2分别连接到pgpu6/gfp/neo载体上，得到表达载体，所述pgpu6/gfp/neo载体如图1所示。然后转化到e.coli dh5α感受态细胞中进行扩增，提取质粒，得到pgpu6-1和pgpu6-2质粒，-20℃保存备用。
41.实施例2
42.对奶山羊zfy基因的体外干扰试验
43.采集成熟奶山羊睾丸组织，采用两步酶消化法分离出睾丸支持细胞和生精细胞。将分离出的支持细胞和生精细胞放入完全培养液(含有fbs、双抗、胰岛素、转铁蛋白、视黄酸、维生素a、维生素e、维生素c、丙酮酸、睾酮)中在35℃、5％co2、湿度为95％的条件下培养24h，用脂质体2000作为转染试剂，将实施例1中保存的两种质粒即pgpu6-1质粒和pgpu6-2质粒，分别转染到生精细胞中，每组重复三次。转染60h后提取生精细胞的总rna，用qrt-pcr检测zfy和zfx基因的mrna表达水平，以空载体为对照组，判定2对干扰片段的干扰效果。试验所用引物如表1和seq id no.7～12所示，qrt-pcr检测生精细胞zfy和zfx基因的mrna表达情况如图2所示。检测zfy基因的引物是以ncbi中登录号为xm_018044894.1的基因系列为模板设置的。检测zfx基因的引物是以ncbi中登录号为xm_018043810.1的基因为模板设置的引物。
44.表1qrt-pcr检测zfy和zfx基因以及内参基因的引物序列
[0045][0046]
如图2显示，实验组pgpu6-2质粒中zfy基因mrna的表达水平低于对照组(空载体组)，且实验组和对照组相比差异极显著(p＜0.01)；初步判定pgpu6-2干扰片段对奶山羊zfy基因具有沉默效果。实验组pgpu6-2干扰片段中zfx基因mrna的表达水平与对照组相比差异不显著(p＜0.05)，说明对zfx基因的表达没有显著影响。实验组pgpu6-1质粒中zfy基因mrna的表达水平也低于对照组(空载体组)，与对照组相比差异极显著，但是实验组pgpu6-1干扰片段中zfx基因mrna的表达水平与对照组相比差异也显著，这说明pgpu6-1干扰片段也会影响zfx基因的表达。
[0047]
实施例3
[0048]
zfy基因的奶山羊体内干扰试验
[0049]
在10ml离心管中加入总含量为3.0mg的质粒(实施例1保存的pgpu6-2质粒)及500μl的双抗，用pbs补充体积至6ml。在陕西陇县奶山羊育种场和千阳县种羊场分别选取3头成熟健康公奶山羊进行试验，先用1.0
×
18的10号穿刺针对睾丸皮肤穿刺，再用0.6
×
122的6号针抽取质粒通过穿刺针进入睾丸内部进行注射，该注射方法避免了因为针头过粗导致睾丸内部的损伤，每头公奶山羊每侧睾丸注射3.0mg，每隔10天注射一次，共注射3次，第3次注射结束后3天可进行配种(陇县奶山羊育种场采用鲜精人工授精、千阳县种羊场采用自然交配)，可持续30天。统计后代羔羊的公母数量。最终统计结果如表2所示。
[0050]
表2后代奶山羊性别统计
[0051]
雄性雌性雌性比例3412879.01％
**
[0052]
由表2得知，经pgpu6-2干扰片段干扰后，奶山羊后代中雌性比例为79.01％，同1:1的性别比例相比差异极显著(p＜0.01)。
[0053]
由以上实施例可知，本发明提供一种奶山羊zfy基因干扰片段与一种表达载体及其应用。奶山羊zfy基因干扰片段的序列如seq id no.1～2所示。利用该干扰片段可以沉默奶山羊zfy基因，并且不影响zfx基因的表达，可以提高后代羔羊中的母羔率，使母羔率达到79.01％。
[0054]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。