东北马鹿微卫星DNA遗传标记的筛选及应用

本发明涉及动物资源学、分子生物学领域，具体地说涉及对欧洲马鹿基因组信息和中亚马鹿基因组信息进行比对分析获得东北马鹿str遗传标记及其应用。

背景技术：

1、鹿在我国民间一直有“鹿身百宝”之说，药用以及食用部分主是鹿血、鹿茸、鹿心、鹿胎、鹿鞭、鹿筋等，其中鹿血的应用范围最广；临床上多用于促进新陈代谢延缓衰老、增强免疫力。鹿血为鹿科动物梅花鹿或马鹿的膛血或茸血，是十分珍贵的中药材。马鹿亦称赤鹿，属偶蹄目(artiodactyla)鹿科(ceridae)鹿亚科(cervinae)，分类学上分为三个独立物种，马鹿、欧洲马鹿和中亚马鹿，其中马鹿在我国分布有8个亚种，东北马鹿(cervuselaphus xanthopygus)是马鹿中养殖开发较多的亚种，在我国经济动物养殖中占有重要地位。然而我国马鹿并无完整的基因组序列、遗传标记信息缺失，种属鉴定和个体识别研究均缺乏参考序列，这些现状限制了马鹿野生资源的保护、人工养殖繁育和鹿产品真伪的生物学鉴定等研究。

2、微卫星dna(microsatellite dna)又称短串联重复序列(short tandem repeat,str)，是一类由1～6个碱基组成的重复序列，长度仅2bp-6bp，重复次数10-60次，总长度多在300bp以下，在真核生物基因组分布广泛，与其他遗传标记相比，微卫星具有多态性好、高灵敏度、结果准确、操作简单等优点，因而被开发成为遗传标记并得到了广泛的应用，尤其是法医学个人识别和亲权鉴定，其技术平台标准化水平高且成熟稳定。

3、2020年hengxing ba等人对中亚马鹿的全基因进行测序，获得基因组大小约为2.60g、由19,010个碱基组成，contign50和scaffoldn50分别为275.5kb和31.7mb，共有34条染色体。2018年nórabana等人对欧洲马鹿的全基因组进行测序，共有33对常染色体，基因组大小约3.0g，contig和scaffold总长度分别为1.95gbp和3.4gbp。本发明通过比较欧洲马鹿和中亚马鹿基因组，筛选多种间通用的特异性str位点，实现对东北马鹿遗传标记的开发，对我国东北马鹿个体识别及遗传育种优化具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于欧洲马鹿基因组信息和中亚马鹿基因组信息进行比对分析筛选东北马鹿str遗传标记的方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

2、一种东北马鹿微卫星dna遗传标记的筛选方法，具体过程如下：采用生物信息学分析欧洲马鹿基因组信息和中亚马鹿基因组信息从而获取东北马鹿微卫星遗传标记位点。从hengxing ba和nórabana等文章中获得和ncbi数据库收集欧洲马鹿(cervus elaphus)基因组信息(ncbi assembly:gca_002197005.1)和中亚马鹿(cervus hanglu)基因组信息(ncbi assembly:gca_010411085.1)，在表1中进行了表述，利用misa(microsatelliteidentification tool)对两种马鹿进行生物信息分析获得str遗传标记信息，将两种马鹿基因组信息进行比对发现了1,315个str在两种马鹿中存在保守的侧翼序列。随机挑选了20个str遗传标记进行pcr-page实验验证。根据微卫星标记重复序列两端的侧翼序列设计引物。

3、以cm41s16基因座为例，根据染色体cm008041.1的16018384-16018410位碱基序列两端的侧翼序列设计引物，引物序列如下：正向引物f:agagcaagcaccgaagttca，反向引物r:gcaagtccctggccactaat。同理，其他引物也是采用同样的方法参照染色体上的具体位置的碱基序列进行设置。

4、表3.20对微卫星引物设置时参考信息*

5、

6、*以ncbi assembly:gca_002197005.1序列信息为参考

7、微卫星引物有效性检验。

8、样本收集与dna提取：东北马鹿血样取自吉林省长春市孙氏鹿业，采集鹿茸时收集新鲜血液，共计48份。每份5ml，acd抗凝，-20℃保存。dna的提取chelex-100提取法。

9、将20对str引物在1个东北马鹿dna样本中进行扩增，检验str引物的有效性。

10、20对微卫星引物在东北马鹿血样中的dna扩增结果显示：在设置五个退火温度梯度的pcr反应程序中，4对引物没有扩增产物，16对引物有扩增产物。

11、选择具有代表性的4个str基因座cm41 s16、cm12s18、cm13s76和cm31 s78在48个东北马鹿dna样品进行扩增，同时对4个位点等位基因的pcr产物进行测序测定，结果显示与预测序列一致，观察结果显示具有较好的多态性，并且获得了4个str基因座基因型频率，计算出各基因座群体遗传学多态性参数。

12、一种马鹿多态性微卫星分子标记组合，其特征在于，所述马鹿多态性微卫星分子标记的组合编号为cm41s16、cm12s18、cm13s76、cm31s78；编号为cm41s16的微卫星分子标记的重复序列为aat，编号为cm12s18的微卫星分子标记的重复序列为aaaat，编号为cm13s76的微卫星分子标记的重复序列为tg，编号为cm31s78的微卫星分子标记的重复序列为gt。微卫星分子标记cm41s16引物对序列为：正向引物f:agagcaagcaccgaagttca，反向引物r:gcaagtccctggccactaat；微卫星分子标记cm12s18引物对序列为：正向引物f:ttgtgttcctcccaccaaaa，反向引物r:cctgaagccactctcccttg；微卫星分子标记cm13s76引物对序列为：正向引物f:acagaaatgtagggctggcc，反向引物r:gtttctcctctcccctccct；微卫星分子标记cm31s78引物对序列为：正向引物f:acagagtgaagacagagagag，反向引物r:cttgagagccccttggactg；

13、通过筛选，其中4对微卫星引物cm41s16、cm12s18、cm13s76和cm31s78在48个马鹿dna样品中检测具有很好的多态性；群体遗传学参数中cm41s16、cm12s18、cm13s76及cm31s78分别检为5、5、8和6个等位基因，基因型15、15、36和21种，其中cm41s16等位基因频率分布范围为0.0417-0.3333；cm12s18等位基因频率分布范围为0.0729-0.3333；cm13s76等位基因频率分布范围为0.0833-0.2291；cm31s78等位基因频率分布范围为0.0625-0.3333；个体识别概率(dp)0.8396、0.9035、0.9584和0.9134,多态性信息量(pic)分别为0.6206、0.7212、0.8281和0.7368。

14、本发明利用20对微卫星引物对东北马鹿的血样进行扩增，共筛选出16个新的微卫星遗传标记在马鹿基因组中有效扩增，可进一步用于马鹿的遗传学研究；通过进一步筛选获得4个遗传标记可用于马鹿物种鉴定和种质资源保护及优化遗传育种。

15、综上所述，本发明的优点及积极效果为：东北马鹿基因组序列尚未完成测序，无法直接通过misa软件等工具挖掘该物种的str位点。本发明通过比较两个近缘物种(欧洲马鹿和中亚马鹿)基因组str位点，筛选出可能在属内种间保守的str序列。以东北马鹿基因组dna为模板，验证这些欧洲马鹿和中亚马鹿种间保守的str位点扩增引物在东北马鹿中应用的可能性，结果表明，通过分析近缘物种基因组dna，实现了对基因组序列未知物种str位点的特异性扩增，并应用于东北马鹿个体识别和遗传育种优化的开发。