1.本发明属于癌细胞分选技术领域，特别涉及一种上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠纳米分选方法。
背景技术：
2.类器官(organoids)是一种利用成体干细胞体外培养出的具有3d结构的细胞培养物，与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能。肿瘤类器官(tumoroids)则是利用患者肿瘤组织体外培养的，与患者肿瘤的结构、生理等高度一致的“微肿瘤”。类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官模型可以复制肿瘤的组织复杂性与遗传异质性，与诸多临床前模型如2d细胞系、pdx模型等相比，类器官在成功率、维护难度、筛选难度上均表现出了良好的潜力，为从基因或蛋白水平研究类器官致癌或癌症相关机制的研究提供宝贵的模型。
3.类器官培养过程中，如何快速有效地分离获取到肿瘤细胞是非常重要的一步，且需要保持良好的细胞回收率及活性；目前此类研究较少。
技术实现要素：
4.本发明的目的是提供一种上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠分选方法。
5.本发明具体操作方式如下：
6.(1)制备功能磁珠：将carboxylic acid活化的磁性纳米粒子加入1-乙基
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3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化；然后加入抗epcam(上皮细胞粘附分子)单克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体和/ 或抗泛ck单克隆抗体，于室温反应,反应完成后用pbs清洗，获得磁珠前驱体；加入牛血清白蛋白(bsa)封闭非特异性吸附位点，制成功能磁珠；
7.(2)制备肿瘤细胞样本：通过accuroid试剂盒的组织消化液对上皮的肿瘤组织样本进行消化，获得带有多种细胞类型的肿瘤细胞样本，将细胞密度稀释至106～107个/ml；
8.(3)细胞分选：取步骤(1)获得的功能磁珠，加入步骤(2)稀释后的肿瘤细胞样本，使用磁力架进行分选，收集肿瘤细胞进行计数，使用流式细胞仪进行肿瘤细胞比例检测。
9.上述的步骤(1)中，所述carboxylic acid活化的磁性纳米粒子成分为氧化铁(ii)和/或氧化铁(iii)。
10.上述的步骤(1)中，所述carboxylic acid活化的磁性纳米粒子平均粒径为30nm。
11.上述的步骤(1)中，所述将磁性纳米粒子加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活化活化，活化时间为3～4h。
12.上述的步骤(1)中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、抗上皮细胞粘附分子单克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体和抗泛ck 单克隆抗体的加入量按摩尔比edc﹕nhs﹕(抗epcam单克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体和/或抗泛ck单克隆抗体)＝1﹕
1.5﹕1.5。
13.上述的步骤(1)中，抗epcam单克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体和/或抗泛ck单克隆抗体的以溶液的形式加入，每种溶液的浓度均为2mg/ml；其中每种成分的加入量与carboxylicacid活化的磁性纳米粒子摩尔比为1.2:1。
14.上述的步骤(1)中，加入抗epcam单克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体和/或抗泛ck单克隆抗体后，于室温反应时间为6～7h。
15.上述的步骤(1)中，用pbs清洗总共清洗三次。
16.上述的步骤(1)中，pbs为pbs缓冲液，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl。
17.上述的步骤(1)中，用pbs清洗是将pbs完全浸没反应后的物料，清洗后分离出去pbs,计为一次。
18.上述的步骤(1)中，牛血清白蛋白的加入量为磁珠前驱体质量的1％。
19.上述的步骤(2)中，所述的消化为将肿瘤细胞从肿瘤组织中分离出来的过程。
20.本发明的优点在于：通过便捷的方法，制备了功能磁珠，将功能磁珠与肿瘤细胞样本进行一步法快速分选，较为精准地筛选肿瘤细胞使其能够快速应用于肿瘤类器官的培养。
具体实施方式
21.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
22.本发明实施例中，carboxylicacid活化的磁性纳米粒子为sigma-aldrich公司购买。
23.本发明实施例中，磁力架为市售强磁吸磁铁
24.本发明实施例中，流式细胞仪为赛默飞的attunenxt。
25.本发明实施例中，所述的消化为将肿瘤细胞从肿瘤组织中分离出来的过程。
26.本发明实施例中，pbs为pbs缓冲液，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl。
27.本发明实施例中，用pbs清洗是将pbs完全浸没反应后的物料，清洗后分离出去pbs,计为一次。
28.本发明实施例中，carboxylicacid为羧酸。
29.实施例1
30.取500ul平均直径为30nm的carboxylicacid活化的磁性纳米粒子，向其加入edc和nhs活化3h；然后加入抗epcam单克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体和抗泛ck单克隆抗体，于室温反应6h；反应完成后用pbs清洗三次；加入bsa封闭非特异性吸附位点；
31.carboxylicacid活化的磁性纳米粒子为氧化铁(ii)；
32.抗epcam单克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体和抗泛ck单克隆抗体以溶液的形式加入，每种溶液的浓度均为2mg/ml；其中每种成分的加入量与carboxylicacid活化的磁性纳米粒子摩尔比为1.2:1；
33.按摩尔比edc﹕nhs﹕(抗epcam单克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体+抗泛ck单克隆抗体)＝1﹕1.5﹕1.5；
34.通过消化获得肿瘤细胞样本，将细胞密度稀释至106个/ml；
35.bsa加入量为磁珠前驱体质量的1％；
36.取50ul功能磁珠，加入200ul肿瘤细胞，使用磁铁进行分选，收集肿瘤细胞进行计数，使用流式细胞仪进行肿瘤细胞比例检测；
37.收集的肿瘤细胞计数结果为分选前肿瘤细胞数量为2.3*106，分选后细胞计数结果为1.1*106；
38.对肿瘤细胞的比例检测结果为分选前肿瘤细胞比例为50％，分选后肿瘤细胞比例为90％。
39.实施例2
40.方法同实施例1，不同点在于：
41.carboxylic acid活化的磁性纳米粒子为氧化铁(iii)；与抗epcam单克隆抗体于室温反应6h；反应完成后用pbs清洗三次；加入bsa封闭非特异性吸附位点；
42.按摩尔比edc﹕nhs﹕抗epcam单克隆抗体＝1﹕1.5﹕1.5；抗epcam单克隆抗体以溶液的形式加入，浓度为2mg/ml；其中抗epcam单克隆抗体的加入量与 carboxylic acid活化的磁性纳米粒子摩尔比为1.2:1；
43.收集的肿瘤细胞计数结果为分选前肿瘤细胞数量为2.3*106，分选后细胞计数结果为1.8*106；
44.对肿瘤细胞的比例检测结果为分选前肿瘤细胞比例为50％，分选后肿瘤细胞比例为63％。
45.实施例3
46.方法同实施例1，不同点在于：
47.carboxylic acid活化的磁性纳米粒子为氧化铁(iii)与抗ki-67单克隆抗体于室温反应6h；反应完成后用pbs清洗三次；加入bsa封闭非特异性吸附位点；
48.按摩尔比edc﹕nhs﹕抗ki-67单克隆抗体＝1﹕1.5﹕1.5；
49.抗ki-67单克隆抗体以溶液的形式加入，浓度为2mg/ml；其中抗ki-67单克隆抗体的加入量与carboxylic acid活化的磁性纳米粒子摩尔比为1.2:1；
50.收集的肿瘤细胞计数结果为分选前肿瘤细胞数量为2.3*106，分选后细胞计数结果为1.6*106；
51.对肿瘤细胞的比例检测结果为分选前肿瘤细胞比例为50％，分选后肿瘤细胞比例为70％。
52.实施例4
53.方法同实施例1，不同点在于：
54.carboxylic acid活化的磁性纳米粒子为氧化铁(iii)与抗泛ck单克隆抗体于室温反应6h；反应完成后用pbs清洗三次；加入bsa封闭非特异性吸附位点；
55.按摩尔比edc﹕nhs﹕抗泛ck单克隆抗体＝1﹕1.5﹕1.5；
56.抗泛ck单克隆抗体以溶液的形式加入，浓度为2mg/ml；其中抗泛ck单克隆抗体的加入量与carboxylic acid活化的磁性纳米粒子摩尔比为1.2:1；
57.收集的肿瘤细胞计数结果为分选前肿瘤细胞数量为2.3*106，分选后细胞计数结果为1.8*106；
58.对肿瘤细胞的比例检测结果为分选前肿瘤细胞比例为50％，分选后肿瘤细胞比例为59％。
59.实施例5
60.carboxylicacid活化的磁性纳米粒子为氧化铁(iii)与抗ki-67单克隆抗体、抗泛ck单克隆抗体于室温反应6h；反应完成后用pbs清洗三次；加入bsa封闭非特异性吸附位点；
61.按摩尔比edc﹕nhs﹕(抗ki-67单克隆抗体+抗泛ck单克隆抗体)＝1﹕1.5﹕1.5；
62.与抗ki-67单克隆抗体和抗泛ck单克隆抗体以溶液的形式加入，浓度为2mg/ml；其中抗ki-67单克隆抗体的加入量与carboxylicacid活化的磁性纳米粒子摩尔比为1.2:1；抗泛ck单克隆抗体的加入量与carboxylicacid活化的磁性纳米粒子摩尔比为1.2:1；
63.收集的肿瘤细胞计数结果为分选前肿瘤细胞数量为2.3*106，分选后细胞计数结果为1.6*106；
64.对肿瘤细胞的比例检测结果为分选前肿瘤细胞比例为50％，分选后肿瘤细胞比例为70％。
65.实施例6
66.方法同实施例1，不同点在于：
67.carboxylicacid活化的磁性纳米粒子为氧化铁(iii)与抗epcam单克隆抗体、抗ki-67单克隆抗体于室温反应6h；反应完成后用pbs清洗三次；加入bsa封闭非特异性吸附位点；
68.按摩尔比edc﹕nhs﹕(抗ki-67单克隆抗体+抗epcam单克隆抗体)＝1﹕1.5﹕1.5；
69.抗epcam单克隆抗体和抗ki-67单克隆抗体以溶液的形式加入，浓度为2mg/ml；其中抗epcam单克隆抗体和抗ki-67单克隆抗体的加入量与carboxylicacid活化的磁性纳米粒子摩尔比均为1.2:1；
70.收集的肿瘤细胞计数结果为分选前肿瘤细胞数量为2.3*106，分选后细胞计数结果为1.55*106；
71.对肿瘤细胞的比例检测结果为分选前肿瘤细胞比例为50％，分选后肿瘤细胞比例为72％。
72.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。