一株异常维克汉姆酵母及其在蓝莓果酒降酸固色中的应用

20221359。
8.本发明的异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5自贵州省茅台镇酱香型高温大曲中分离出来，使用酵母its通用引物通过pcr扩增编码菌株的26s核糖体rna的dna片段(seq id no.1所示)，pcr产物送至生工公司进行测序。测序结果提交至genbank数据库，进行blast并与其他报道的序列进行比对，使用mega11.0软件通过邻接法构建系统发育树。
9.通过特征序列构建系统发育树，y5与mn46415.1 wickerhamomyces anomalus strain w2高度相似，因此，本发明的菌株为异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)，命名为异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5。
10.本发明提供一种筛选具有羟基肉桂酸脱羧酶活性酵母的方案，该方案分为定性(初筛)和定量(复筛)两步。
11.(1)初筛：ypd筛选培养基为：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％无水葡萄糖，分别添加0.145％的对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸，并添加0.01％的溴甲酚紫作为指示剂，相应的固体筛选培养基添加2％的琼脂。具有hcdc活性的酵母通过ypd筛选培养基的颜色从黄色变为紫色来筛选，这是由于羟基肉桂酸的脱羧作用从而使环境碱化，导致溴甲酚紫指示颜色从黄到紫的变化进而可以快速筛选出具有hcdc活性的酵母。将活化后的菌液用平板划线法在ypd固体培养基上进行纯化培养2-3d，培养于30℃恒温培养箱中直到出现菌落。纯化2-3次后挑取单菌落，点涂到ypd筛选培养基上培养。培养3-7d后观察筛选培养基上酵母菌落的生长及平板变色情况，若菌落周围出现紫色区域，表明该菌株分泌羟基肉桂酸脱羧酶。
12.(2)复筛：将y5的单个菌落接种到装有有50ml的ypd液体培养基的250ml锥形瓶中，30℃，200rpm孵育24h，得到y5种子液。随后接种200μl(od
600
＝1)的y5种子液于液体ypd筛选培养基中，30℃，200rpm孵育至培养基变为紫色终止发酵。
13.本发明提供一种微生物菌剂，所述菌剂中含有上述异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5或其发酵液，或含有上述异常维克汉姆酵母y5的冻干粉。
14.在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
15.在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5的含量至少为：106个cell/ml湿菌体或106个cell/g干菌体。
16.本发明还提供了一种含有上述异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5的组合物。
17.在本发明的一种实施方式中，所述组合物中，异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5的含量至少为：106个/ml湿菌体或106个/g干菌体。
18.本发明还提供了一种上述异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5，或上述微生物菌剂，或上述组合物在生产发酵制品中的应用。
19.在本发明的一种实施方式中，所述发酵制品为发酵食品或发酵饮品。
20.在本发明的一种实施方式中，所述发酵饮品包括但不限于发酵酒精饮料。
21.在本发明的一种实施方式中，所述发酵酒精饮料包括但不限于：葡萄酒及其他含花色苷的果酒等。
22.在本发明的一种实施方式中，所述果酒为蓝莓果酒。
23.本发明还提供了一种制备蓝莓果酒的方法，所述方法是用含蓝莓果汁的发酵原料，利用上述异常维克汉姆酵母y5，发酵制备果酒。
24.在本发明的一种实施方式中，蓝莓汁的制备：
25.(1)对新鲜蓝莓的进行筛选后破碎打浆，得到混合液；
26.(2)向混合液中添加20mg/kg的果胶酶在ph为2.5，30℃条件下进行酶解2h，酶活为30000u/g，制备得到酶解液；
27.(3)调整酶解液的总糖含量为200g/l、ph为2.5，在4℃下，用冷冻离心机以8000
×
g的转速离心10min，取上清液。
28.(4)向上清液中添加60～80mg/kg偏重亚硫酸钾进行杀菌12-24小时后制备得到蓝莓汁。
29.在本发明的一种实施方式中，所述果酒的制备方法具体为：
30.(1)在蓝莓汁中加入白砂糖，使蓝莓汁最终糖度达到180-220g/l，其初始ph为2.7-3.5。将300ml蓝莓汁分配到每个500ml锥形瓶中，并在121℃下灭菌15min。
31.(2)将异常维克汉姆酵母y5接种至ypd培养基中，在28-30℃预培养36-48h后，制备得到种子液；
32.将制备得到的种子液接种于灭菌的蓝莓汁(冷却至室温)中，至浓度为10
5-106个cell/ml。随后，在锥形瓶上装上单向排气阀，将培养物在静态条件25-30℃孵育5-10d，过滤后即得蓝莓果酒。
33.本发明还提供了一种提高果酒中花青素稳定性的方法，所述方法为，在果酒的发酵过程中添加上述异常维克汉姆酵母y5。
34.本发明还提供了一种改善果酒风味的方法，所述方法为，在果酒的发酵过程中添加上述异常维克汉姆酵母y5。
35.有益效果
36.(1)本发明利用具有羟基肉桂酸活性的异常维克汉姆酵母y5发酵蓝莓果汁能催化果汁中的羟基肉桂酸脱羧成为相应的乙烯基酚，在7天的发酵过程中，乙烯基酚进一步与花色苷加合生成稳定性更好6种吡喃花色苷(矢车菊素-3-o-半乳糖苷/葡萄糖苷-4-乙烯基儿茶酚、矢车菊素-3-o-半乳糖苷/葡萄糖苷-4-乙烯基丁香酚、锦葵素-4-乙烯基儿茶酚、锦葵素-4-乙烯基愈创木酚)。根据我们前期对蓝莓果汁中花色苷的检测分析结果可知，目前蓝莓果汁中能检测出43种花色苷(如表2所示)，不难推测出通过发酵条件的改变，如延长发酵时间、增大接菌量、改变发酵温度及调整果汁浓度，还将会有更多的吡喃花色苷形成，因此该技术方案能有效提高蓝莓果酒色泽稳定性。
37.(2)吡喃花色苷相较花色苷有更高的光稳定性和热稳定性，但其通常在葡萄酒的陈酿过程中(一般大于1年)缓慢形成，而本技术方案只需利用y5进行发酵仅仅7d就能形成吡喃花色苷，该技术方案使提高蓝莓果酒颜色稳定性的周期变短。
38.(3)蓝莓中富含羟基肉桂酸(主要包含对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸)除能引起口感酸味，还能通过连续脱羧和还原产生引起嗅觉缺陷的挥发性酚。本技术方案可快速将羟基肉桂酸脱酸形成乙烯基酚，乙烯基酚与花色苷的加合形成更稳定的吡喃花色苷，既避免了由羟基肉桂酸引起的口感酸味，也避免了其进一步被还原产生引起嗅觉缺陷的挥发性酚，对蓝莓果酒的风味有很好的改善效果。
39.(4)采用本发明的异常维克汉姆酵母y5发酵制备蓝莓果汁或者蓝莓果酒，该制备方法具有降酸、固色的功效；并且本发明的方法不需要额外添加任何物质，而现有技术当中制备稳定的花色苷需要额外添加对香豆酸；本技术方案巧妙的将蓝莓果汁中富含的咖啡酸、阿魏酸转化成可与花色苷加合成更稳定乙烯基酚吡喃花色苷的中间体，可同时实现对蓝莓果酒的降酸、固色；本技术方案所述的wickerhamomyces anomalus y5是从大曲酱香性白酒的发酵剂高温大曲中筛选得到，经测定，其不产h2s，与大多数酵母会产生h2s相比，该菌株具有显而易见的优势，因此在果酒酿造具有明显的实际应用价值。
40.生物材料保藏
41.一株异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5，分类学命名为：wickerhamomyces anomalus y5；已于2022年09月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为cctcc no:m 20221359。
附图说明
42.图1：羟基肉桂酸生成异嗅乙基酚的反应。
43.图2：异常维克汉姆酵母y5在筛选培养基上培养1、3、7天后的显色圈及其显微形态。
44.图3：异常维克汉姆酵母y5系统发育树。
45.图4：异常维克汉姆酵母y5对不同羟基肉桂酸的脱羧转化率。
46.图5：异常维克汉姆酵母y5发酵蓝莓果汁过程中矢车菊素-3-糖苷(c3g)随时间变化情况。
47.图6：异常维克汉姆酵母y5发酵蓝莓果酒和未接菌蓝莓果汁中花色苷变化；其中，a：蓝莓果汁和蓝莓果酒中部分花色苷含量变化，
“☆”
表示果酒中显著比果汁中减少的花色苷；b：蓝莓果汁中花色苷的hplc分析图谱；c：蓝莓果酒中花色苷的hplc分析图谱；红色框表示蓝莓果酒中新生成的花色苷；d：新生成的峰的质谱分析结果。
48.图7：y5发酵蓝莓果酒过程中羟基肉桂酸和花色苷发生的反应。
49.图8：蓝莓果汁中的酚酸分析。
50.图9：所筛选菌株在biggy培养基上的显色情况。
具体实施方式
51.下述实施例中所涉及的咖啡酸标准品、对香豆酸标准品、阿魏酸标准品及溴甲酚紫均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
52.下述实施例中所涉及的培养基如下：
53.ypd筛选培养基：1％(w/v)yeast extract(酵母膏)，2％(w/v)peptone(蛋白胨)，2％(w/v)glucose(葡萄糖)，0.145％(w/v)hydroxycinnamic acid(羟基肉桂酸)，0.01％(w/v)bromocresol purple(溴甲酚紫)，121℃灭菌20min，即得。如果为ypd固体筛选平板，则需在配制时额外加入2％(w/v)agar(琼脂)，121℃灭菌20min后，冷却至65-75℃之间，倒平板，待平板培养基凝固后，即得。
54.ypd液体培养基：1％(w/v)yeast extract(酵母膏)，2％(w/v)peptone(蛋白胨)，2％(w/v)glucose(葡萄糖)，121℃灭菌20min即得。
55.biggy(bismuth glucose glycine y east)培养基：购自英国oxoid。配方：0.1％(w/v)yeast extract(酵母浸粉)，1％(w/v)glycine(甘氨酸)，1％(w/v)dextrose(葡萄糖)，0.5％(w/v)ammonium bismuth citrate(柠檬酸铋铵)，0.3％(w/v)sodium sulfite(亚硫酸钠)，1.6％(w/v)agar(琼脂)，ph 6.8
±
0.2(25℃)，加水溶解后，搅拌煮沸1min，冷却至50～55℃混匀，倾注平板。
56.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
57.对香豆酸、咖啡酸及阿魏酸的脱羧转化率：
58.取1ml发酵液4℃，5000g，离心5min后，用0.22μm滤膜过滤得滤液，通过hplc分析y5对对香豆酸、咖啡酸及阿魏酸的脱羧转化率，转化率根据公式计算。
[0059][0060]
式中，ha表示羟基肉桂酸(对香豆酸、咖啡酸及阿魏酸)，ha
inatial
表示初始羟基肉桂酸量，ha
remained
表示经发酵后还未被脱羧的羟基肉桂酸。
[0061]
hplc分析条件：sb-c18色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)(agilent，美国)和二极管检测器(dad)。进样量10μl，柱温40℃，检测波长320nm。流动相为a相：0.1％甲酸-水和b相：0.1％甲酸-乙腈，a:b为90:10，流速为1ml/min。
[0062]
hcdc活性的检测：
[0063]
将1ml发酵结束后产物使用冷冻离心机以5000g，4℃下离心5min，并通过0.22μm水系针头过滤器过滤，并通过hplc分析以定量代谢的咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸和芥子酸，根据下列公式得出hcdc活性。
[0064][0065]
式中，ha表示羟基肉桂酸(hydroxycinnamic acid，ha)，本技术中分别以咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸和阿魏酸为底物测定了y5的羟基肉桂酸酶活性，ha
inatial
表示筛选培养基中初始羟基肉桂酸量，ha
remained
表示经y5发酵后还未被脱羧的羟基肉桂酸含量，ha
control
表示未接y5的同样培养条件孵育的空白样品中羟基肉桂酸的含量。
[0066]
使用带有sb-c18色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)(agilent，美国)和二极管检测器(dad)的hplc来确定对香豆酸、咖啡酸及阿魏酸的浓度。进样量10μl，柱温40℃，检测波长320nm。流动相为a相：0.1％甲酸-水和b相：0.1％甲酸-乙腈，a:b为90:10，流速为1ml/min。
[0067]
实施例1：异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5的制备
[0068]
本发明异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5是从贵州省茅台镇酱香型高温大曲中分离出来的并保存，经多次纯化后在40％甘油管中、-20℃下保藏，筛选过程如下：
[0069]
(1)初筛：具有hcdc活性的酵母可以将筛选培养基中的羟基肉桂酸的脱羧，使培养基从酸性到中性变化导致溴甲酚紫指示颜色从黄到紫，进而可以实现快速筛选具有hcdc活性的酵母的目的(图2)。取大曲1g于99ml无菌生理盐水中，涡旋振荡5min后，梯度稀释后于ypd筛选培养基平板上涂布，培养2-3d后，挑取菌落周围变紫的菌落在ypd筛选培养基平板冲划线纯化、分离，纯化分离过程重复2-3次后，经显微形态、生理生化及分子鉴定后，用
20％终浓度的甘油管保藏菌种于-80℃。
[0070]
(2)复筛：将y5的单个菌落接种到装有有50ml的ypd液体培养基的250ml锥形瓶中，30℃，200rpm孵育24h，得到y5种子液。随后接种200μl(od
600
＝1)的y5种子液于液体ypd筛选培养基中，30℃，200rpm孵育至培养基变为紫色终止发酵。取1ml发酵液4℃，5000g，离心5min后，用0.22μm滤膜过滤得滤液，通过hplc分析y5对对香豆酸、咖啡酸及阿魏酸的脱羧转化率。
[0071]
(3)鉴定
[0072]
使用rapid fungi genomic dna isolation kit(sangon biotech，china)提取菌株的基因组dna。使用酵母its通用引物通过pcr扩增编码菌株的26s核糖体rna的dna片段。pcr产物送至生工公司进行测序，序列如seq id no.1所示。
[0073]
测序结果提交至genbank数据库，进行blast并与其他报道的序列进行比对，使用mega11.0软件通过邻接法构建系统发育树(图3)。通过特征序列构建系统发育树，y5与mn46415.1 wickerhamomyces anomalus strain w2高度相似，因此，本发明的菌株为异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)，命名为异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5。
[0074]
实施例2：异常维克汉姆酵母y5对咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸和芥子酸的影响及其性能研究
[0075]
具体步骤如下：
[0076]
1、异常维克汉姆酵母y5对咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸和芥子酸的影响
[0077]
(1)将异常维克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)y5单个菌落接种到含有50ml的ypd液体培养基的250ml锥形瓶中制备酵母预培养物，并在30℃下以200rpm孵育24h；制备得到种子液，将制备得到的种子液接种200μl(od
600
＝1)的酵母预培养物于50ml的ypd液体筛选培养基中，置于30℃摇床下以200rpm孵育2-3d，得到发酵产物；
[0078]
(2)将1ml上述发酵产物使用冷冻离心机以5000g，4℃下离心5min，并通过0.22μm水系针头过滤器过滤，并通过hplc分析以定量代谢的咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸和芥子酸，对其脱羧活性进行评价；其脱羧活性评价如图4所示。
[0079]
结果显示：由图4可知，y5在30℃发酵7d即可分别将对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸转化为4-乙烯基苯酚、4-乙烯基儿茶酚和4-乙烯基愈创木酚，转化率分别为：82.63％、77.55％68.12％；即：异常维克汉姆酵母y5对对香豆酸的脱羧活性为82.63％，对咖啡酸的脱羧活性为77.55％，对阿魏酸的脱羧活性为68.12％。
[0080]
而记载于公开号为cn 114250159a中所述的威克汉姆酵母d6的对香豆酸的脱羧活性仅为78.71％，不及本发明中y5对对香豆酸的脱羧活性82.63％。并且，本发明的中的y5咖啡酸、阿魏酸的脱羧活性也很高。
[0081]
2、异常维克汉姆酵母y5不产h2s
[0082]
biggy(bismuth glucose glycine yeast)琼脂是一种选择性培养基，可通过硫化氢(h2s)将亚硫酸盐还原为硫化物，从而显示棕色至黑色，可用于筛选和鉴定酵母的硫化氢生产能力
[0083]
具体步骤如下：
[0084]
(1)异常维克汉姆酵母y5酵母悬液的制备
[0085]
从异常维克汉姆酵母y5的甘油管中接200μl菌液至新鲜配制的50ml的ypd培养基中，28～30℃，200rpm培养1d进行活化，再将新鲜活化的y5的菌液200μl转接至新鲜活化的ypd培养基中，28～30℃，200rpm培养1d进行扩培，制得y5菌悬液备用；按照上述方法，制备得到y1～y4菌悬液，y6～y10菌悬液。
[0086]
其中菌株y1～y4，y6～y10分别是同期筛选菌株。
[0087]
(2)分别将1μl酵母悬液点在biggy琼脂培养基上，28℃培养2d后观察菌落周围颜色变化。白色和浅棕色分别表示h2s无产或低产，深棕色表示h2s产生了一些，黑色表示h2s产率高。
[0088]
结果显示(图9)，biggy琼脂上的浅黄色菌落表明y1、y2和y3产生了少量h2s，棕色菌落表明y4、y6、y7、y8、y9、y10产生h2s，这会导致蓝莓酒变味。
[0089]
而y5的白色菌落表明y5不产生h2s，因此，y5是所筛选菌株中最适合发酵蓝莓酒的菌株。
[0090]
实施例3：异常维克汉姆酵母y5对蓝莓果酒的影响
[0091]
具体步骤如下：
[0092]
1、蓝莓汁的制备
[0093]
(1)对新鲜蓝莓的进行筛选后破碎打浆，得到混合液；
[0094]
(2)向混合液中添加20mg/kg的果胶酶在ph为2.5，30℃条件下进行酶解2h，酶活为30000u/g，制备得到酶解液；
[0095]
(3)调整酶解液的总糖含量为200g/l、ph为2.5，在4℃下，用冷冻离心机以8000
×
g的转速离心10min，取上清液。
[0096]
(4)向上清液中添加60～80mg/kg偏重亚硫酸钾进行杀菌12-24小时后制备得到蓝莓汁。
[0097]
2、蓝莓酒的制备
[0098]
(1)蓝莓汁的预处理
[0099]
向糖度为135g/l的蓝莓汁中，加入白砂糖65g/l，使蓝莓汁最终糖度达到200g/l，检测其初始ph为2.7；将300ml蓝莓汁分配到每个500ml锥形瓶中，并在121℃下灭菌15分钟；
[0100]
(2)蓝莓果酒的制备
[0101]
将异常维克汉姆酵母y5在ypd培养基中30℃预培养48h后，接种于步骤(1)得到的灭菌的蓝莓汁(冷却至室温)中，至浓度为105个cell/ml。随后，在锥形瓶上装上单向排气阀，将培养物在静态条件30℃孵育7d，制备得到蓝莓果酒；
[0102]
同时以未接种任何酵母的步骤(1)得到的蓝莓汁作为对照。
[0103]
每天取样，贮藏与-20℃冰箱。最终所有样品过0.22μm滤膜，用hplc测定其中花色苷变化，发酵过程中发生的反应如表1所示；实验结果如图5～7所示。
[0104]
表1：y5发酵蓝莓果汁过程中催化3种酚酸脱羧加合花色苷形成相应吡喃花色苷
[0105][0106]
注：a中的酚酸和b为存在于果汁中的物质，y5在发酵过程中起到了把a脱羧成可以与b反应生成c的物质。
[0107]
结果显示：
[0108]
(1)由表1可知，y5可以在发酵蓝莓果汁制备蓝莓果酒过程中，仅需要发酵7天，无需外加任何物质，即可将蓝莓果汁中的含量较高的咖啡酸和阿魏酸脱羧分别生成4-乙烯基儿茶酚和4-乙烯基愈创木酚，而4-乙烯基儿茶酚和4-乙烯基愈创木酚可以和花色苷进一步加合生成稳定性更好的3种乙烯基酚吡喃花色苷。该技术方案不仅可以消耗蓝莓果汁中的咖啡酸和阿魏酸，还可以将其进一步脱酸，并使其与花色苷加合生成稳定性更高的相应的乙烯基酚吡喃花色苷，从源头实现同时对蓝莓果酒的降酸、固色。
[0109]
(2)经检测，与蓝莓汁中20.92mg/ml的c3g(矢车菊素-3-o-半乳糖苷/葡萄糖苷)含量相比，用异常维克汉姆酵母y5发酵1d后c3g下降至9.63mg/ml，发酵2d后c3g检测不到。在2～5d的样品中，在38min的保留时间附近出现了两个新的峰。
[0110]
(3)进一步由苏州帕诺米克公司采用lc-esi-ms对蓝莓汁和发酵7d后的得到的蓝莓酒进行花色苷靶向代谢分析(图6a)，结果显示：与对照相比，采用异常维克汉姆酵母y5发酵制备的蓝莓酒中矢车菊素-3-o-半乳糖苷/葡萄糖苷(c3g)、锦葵素的含量分别从30595.7ng/ml下降至26223.6ng/ml、255.9ng/ml下降至178.8ng/ml。
[0111]
(4)进一步用lc-ms进一步分析了上述蓝莓汁(图6b)和蓝莓酒(图6c)样品。蓝莓果汁中的花色苷如表2、图8a～b所示。
[0112]
表2蓝莓果汁中的花色苷
[0113][0114][0115]
与蓝莓汁(表2)相比，蓝莓酒在18-20min的保留时间形成了新的峰：
[0116]
质谱(ms)分析表明，谱图中存在m/z分别为581.13(100％)、582.13(31.4％)和583.14(2.7％)的分子离子峰，与矢车菊素-3-o-半乳糖苷/葡萄糖苷-4-乙烯基儿茶酚(c3g-4-乙烯基儿茶酚，c
29h25o13
+)分子离子峰特征一致(图6da)。
[0117]
m/z分别为625.16(100％)、626.16(33.5％)和627.16(2.9％)的分子离子峰与矢车菊素-3-o-半乳糖苷/葡萄糖苷-4-乙烯基丁香酚的分子离子峰特征一致(c3g-4-乙烯基丁香醇，c31h29o14+)(图6db)。
[0118]
m/z为463.10(100％)、464.11(27％)和465.11(2.7％)的分子离子峰与锦葵素-4-乙烯基儿茶酚(c
26h21o9+
)的分子离子峰特征一致(图6dc)。
[0119]
m/z为477.12(100％)、478.12(28.1％)和479.12(2.7％)的分子离子峰与锦葵素-4-乙烯基愈创木酚(c
25h19o9+
)的分子离子峰特征一致(图6dd)。
[0120]
因此，与蓝莓汁相比，用y5发酵的蓝莓酒中额外形成了四种吡喃花青素，表明y5可以促进蓝莓酒中颜色更稳定的乙烯基苯酚吡喃花青素的形成。参与形成四种乙烯基苯酚吡喃花青素的反应如图7所示。乙烯基酚吡喃花色苷的生成消耗了相应的羟基肉桂酸，因而在固色的同时也实现了降酸(羟基肉桂酸)，避免了由羟基肉桂酸引起的口感酸味的同时也避免了其进一步被还原产生引起嗅觉缺陷的挥发性酚。
[0121]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。