一种环孢霉素A的核酸适配体及其筛选方法与应用与流程

本发明涉及核酸适配体的筛选和应用，更具体地，涉及一种环孢霉素a的核酸适配体及其筛选方法与应用。

背景技术：

1、治疗药物监测(tdm)是确定患者血液中药物浓度以管理其毒性的必要手段。环孢霉素a(csa)是一种免疫抑制药物，用于预防移植排斥反应。csa的tdm是必需的，因为csa的治疗窗口狭窄，所以必须对csa在全血中的浓度进行监测，使其保持在100～450ng/ml，以减少其副作用。

2、相关技术中，多通过酶联免疫吸附试验(elisa)、高效液相色谱-质谱仪和高效液相-质谱仪/质谱仪来测定csa浓度。elisa的检测机制是基于对csa的代谢产物进行识别，而不是csa本身。高效液相色谱-质谱仪和高效液相-质谱仪/质谱仪能够直接对csa进行监测，而不是其代谢物，但存在耗时长、设备昂贵等问题。而适配体是一种短单链寡核苷酸，具有很强的亲和性和特异性，靶标广泛，如离子、小分子、大分子、病毒、细胞等。基于核酸适配体分子信标的生物传感器检测技术，具有操作简单、高灵敏度、小型化、自动化等优点，已广泛应用于细胞生理学、药物筛选及靶向、食品环境安全检测、疾病诊断等领域。

3、因此，需要开发一种简便、灵敏的方法来测定血液样本中的环孢霉素a浓度。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种环孢霉素a的核酸适配体，能够特异性识别环孢霉素a。

2、本发明还提供上述核酸适配体的衍生物。

3、本发明还提供上述核酸适配体的筛选方法。

4、本发明还提供上述核酸适配体或核酸适配体的衍生物的应用。

5、本发明还提供包含上述核酸适配体或核酸适配体的衍生物的产品。

6、本发明还提供一种检测环孢霉素a的方法。

7、术语“ssdna”指单链dna。

8、根据本发明的第一方面实施例的环孢霉素a的核酸适配体，包括a1至a3中的至少一种：

9、a1：如seq id no.1～16任一项所示的单链dna分子；

10、a2、与seq id no.1～16任一项所示的单链dna分子具有60％以上同源性，且具有相同功能的单链dna分子；

11、a3、将seq id no.1～16任一项所示的单链dna分子删除、增加或替换一个或几个核苷酸，且具有相同功能的单链dna分子。

12、根据本发明实施例的核酸适配体，至少具有如下有益效果：

13、实施例的核酸适配体对环孢霉素a的亲和力强、特异性好。具有可体外合成、易于修饰、稳定性高等优点。其操作简单、高灵敏度、小型化、自动化的优点，可应用于食品安全检测、环境卫生监测以及疾病诊断等领域。

14、可以理解的是，a2中所述的单链dna分子，可以为：包含seq id no.1～16任一项所示的单链dna分子中的第21位至64位核苷酸序列的单链dna分子。

15、根据本发明的一些实施例，所述核酸适配体可以为人工合成的序列，或任何其他来源的核苷酸序列同样的其他核酸分子。

16、根据本发明的第二方面实施例的环孢霉素a的核酸适配体的衍生物，包括b1至b4中的至少一种：

17、b1、将上述核酸适配体的一端或中间连接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，且具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

18、b2、由上述核酸适配体编码的rna分子；

19、b3、由上述核酸适配体编码的肽核酸；

20、b4、将上述核酸适配体进行核苷酸修饰，且具有相同功能的核酸适配体的衍生物。

21、根据本发明的一些实施例，所述信号分子或活性分子或功能基团包括荧光或淬灭基团、放射性物质、蛋白、抗体、sirna、氨基、异硫氰酸荧光素、生物素、地高辛、纳米材料、聚乙二醇、叶酸或酶标记中的至少一种。所述荧光基团包括荧光素、罗丹明、花青素。所述纳米材料包括银纳米颗粒、金纳米颗粒中的至少一种。所述酶标记包括辣根过氧化物酶。

22、根据本发明的一些实施例，所述核苷酸修饰包括氨基化、磷酸化、羧基化、硫代修饰、巯基修饰、2-甲氧基修饰、3'端倒置dt/dg修饰、甲基/去甲基化或同位素化的修饰中的至少一种。

23、根据本发明的第三方面实施例的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：

24、s1：将随机ssdna文库与环孢霉素a混合，孵育，得第一混合物；

25、s2：将所述第一混合物与go混合，孵育，留上清，即得第一富集文库；

26、s3：对所述第一富集文库进行pcr扩增，得到扩增产物；

27、s4：将所述扩增产物进行纯化，得到第二富集文库；

28、s5：用所述第二富集文库替代所述步骤s1的随机ssdna文库，重复步骤s2至s4，直至筛选出亲和力高、特异性强的核酸适配体。

29、根据本发明实施例的筛选方法，至少具有如下有益效果：

30、实施例的筛选方法以天然状态的csa为靶标，采用非固定化go-selex筛选得到富集文库，然后通过克隆测序、序列分析、moe分子模拟对接，获得最优的核酸适配体序列。

31、根据本发明的一些实施例，步骤s3中，用于扩增所述第一富集文库的引物fp和rp的核苷酸序列如下：

32、fp：5’-tgagaggagcagatggacat-3’；

33、rp：5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-spacer 18-ttacgggtgtgtcatgctgt-3’。

34、根据本发明的一些实施例，所述fp的5’端连接有荧光基团。所述荧光基团选自cy3、fitc或fam。

35、根据本发明的一些实施例，在步骤s2中实施反筛选过程，以去除非特异性适配体。优选在第7轮实施反筛选过程。用于反筛选过程的靶标包括氢化可的松、四环素、卡马西平和酮康唑中的至少一种。

36、根据本发明的一些实施例，步骤s5中，所述步骤s2至s4的重复次数为7～9次。优选为8次。

37、根据本发明的第四方面实施例的上述核酸适配体或核酸适配体的衍生物的应用。

38、根据本发明的一些实施例，上述核酸适配体或核酸适配体的衍生物在检测环孢霉素a中的应用。

39、根据本发明的一些实施例，上述核酸适配体或核酸适配体的衍生物在制备产品中的应用，所述产品具有c1至c4中的至少一种功能，

40、c1：检测和/或辅助检测环孢霉素a；

41、c2：识别和/或辅助识别环孢霉素a；

42、c3：结合和/或辅助结合环孢霉素a；

43、c4：捕获或提取待测样品中的环孢霉素a。

44、根据本发明的第五方面实施例的一种产品，包括上述核酸适配体或核酸适配体的衍生物。

45、根据本发明的一些实施例，上述核酸适配体或核酸适配体的衍生物作为有效成分。应用上述核酸适配体或核酸适配体的衍生物的产品，相比于其他抗体等检测产品，其反应条件更加简单，并且稳定性更高，成本更加低廉。

46、根据本发明的一些实施例，所述产品具有d1至d4中的至少一种功能，

47、d1：用于检测和/或辅助检测环孢霉素a；

48、d2：用于识别和/或辅助识别环孢霉素a；

49、d3：用于结合和/或辅助结合环孢霉素a；

50、d4：用于捕获或提取待测样品中的环孢霉素a。

51、根据本发明的一些实施例，所述产品为试剂盒、传感器、试纸、芯片、探针或靶向物质中的至少一种。

52、根据本发明的一些实施例，所述产品为传感器，还可以包括纳米金溶液和nacl溶液中的至少一种。

53、根据本发明的一些实施例，所述适配体溶液的浓度为0.8μm～1.2μm。优选为1μm。

54、根据本发明的一些实施例，所述纳米金溶液的浓度为0.1g/l～0.3g/l。优选为0.2.g/l。

55、根据本发明的一些实施例，所述nacl溶液的浓度为3m～3.5m。优选为3m。

56、根据本发明的第六方面实施例的一种检测环孢霉素a的方法，包括以下步骤：

57、将上述核酸适配体，或上述核酸适配体的衍生物，或上述产品作为有效成分作用于待测样品。

58、由上述核酸适配体建立的快速可视化检测csa的方法，检出限可低至ng/ml级别，且可在短时间内完成，结果肉眼可见、操作简单、回收率高，显示了良好的应用前景。

59、根据本发明的一些实施例，所述方法具体包括以下步骤：

60、将上述核酸适配体，或上述核酸适配体的衍生物，或上述产品与待测样品混合，孵育，检测孵育前后的荧光变化。

61、根据本发明的一些实施例，样品可以为环境、食品、工具、离体样本或生物源性材料。

62、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。