C反应蛋白（CRP）检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物领域，具体的涉及c反应蛋白(crp)检测试剂盒。

背景技术：

1、c反应蛋白又称crp，是一种急性时相反应蛋白，可由肝细胞合成。当病原体轻度刺激或组织损伤时，肝细胞合成迅速启动，6h内c反应蛋白浓度达到病理水平(＞8mg/l),48～72h内达到峰值，直接反映早期组织炎性坏死。crp作为急性时相反应的一个极灵敏的指标，具有多种生物活性，它的浓度和分泌水平不因进食和抗炎药物等改变。因此c反应蛋白高低变化与疾病的炎性反应及严重程度具有重要的相关性，c反应蛋白是最有效和最通用的炎性反应标记物。在细菌与病毒感染、组织创伤、脑梗死、心肌梗塞、心血管疾病等多种疾病中，c反应蛋白的检测具有一定的意义。

2、crp在某些疾病上的具体应用包括如下几种疾病。下呼吸道感染：细菌性感染时crp明显高于病毒感染。细菌性肺炎时crp大幅度增高，平均值可达200mg/l。crp值取决于感染的持续时间。病毒性肺炎并发细菌感染，如果crp值偏低，那么在给予抗生素治疗前还需要观察和检测，如果值很高应立即给予抗生素治疗。连续监测crp水平下降，这是治疗效果满意的指标。crp水平在3-4天内下降，2-4周内恢复到正常附近水平，表示很好的治疗效果。细菌和病毒引起的呼吸道感染临床症状有时很难区分，crp可以帮助作判断，决定是否抗生素早期治疗。如果发病<12小时，即使有细菌感染的明显表现，crp值可以是正常的。但是12小时后crp值异常的话可以证实为细菌感染。泌尿系统感染：膀胱炎病人crp水平<30-50mg/l，肾盂肾炎>10-20mg/l，中值75mg/l,最高230mg/l，crp检测特别对不能表达症状的病人(婴儿、昏迷、痴呆病人等)，有良好的提示作用。此外对评价泌尿系统感染的严重程度有重要作用。妇科及孕妇的感染：孕妇crp从怀孕时的6mg/l，分娩时上升到20mg/l，顺产24小时后升到60mg/l，24小时减到25mg/l，剖腹产48小时后平均升到150mg/l。更高水平的crp表示感染。妇科炎症性疾病如子宫附件炎，急性与慢性盆腔炎crp值显著高于非炎性疾病。急性与慢性炎症crp值有显著差异，与wbc部分相关。在盆腔炎治疗后crp在抗生素治疗前后变化幅度值明显大于wbc值，说明crp敏感性较高。crp动态观察可以较好的指导临床用药。单一观察wbc值可能会掩盖对疾病发生发展及治疗效果观察。婴儿和儿童感染：婴儿时期严重感染的临床特征往往模糊不清。crp增高对婴儿感染有更高的的特异性和敏感性。连续的crp测定对诊断更有价值。发热患儿如果症状持续>12小时之间在测crp水平<20mg/l，临床上不能确诊细菌感染，可以怀疑为病毒感染，或在8--12小时之间在测crp的值可排除或证实细菌感染的可能。败血症、心内膜炎、脑膜炎和骨髓炎：crp的值水平较高，均值为150-200mg/l。crp迅速下降至正常是疾病好转和抗生素治疗有效的标志。大龄儿，成人患细菌性脑膜炎时，症状超过12小时，cpr极少低于50mg/l，而症状小于12小时，crp可能会正常。几小时在测会出现高浓度的crp值。急性阑尾炎：发病时间少于12小时，crp可能正常，几小时后进行第二次检测可得到有诊断价值的结果。和wbc计数综合分析是诊断的最佳指标。郑建方报道了400列crp与wbc对急性阑尾炎诊断价值的研究提示：crp与wbc均正常者可以排除急性阑尾炎，其预测效率为100％。这种病例根据临床症状尽量采取保守治疗，并多次测crp、wbc，当某一指标升高，在全面考虑是否手术。组织损伤：术后6-8小时crp开始增加，2-4天达到最高水平。胆腹镜，开放式胆囊切除，前者crp的均值为20mg/l,后者均值100mg/l。急性肝移植排斥反应不会引起crp升高，术后细菌感染crp可大幅度升高。肝功减退的病人，蛋白合成障碍术后crp会低于正常人。评估crp时应考虑肝功影响。手术后感染：术后6天或6天后crp>75mg/l明显提示有并发症可能。疑似急性肠梗阻，crp持续高或不断上升趋势，提示并发症可能。每天crp测定的动态观察，对发现感染很有价值。心血管疾病：对健康人群首发心血管事件的预测，把hs-crp纳入常规的胆固醇筛查:(1)、提高对心血管风险预测的水平，而不再单独依赖于ldl-c的预测(2)、hs-crp浓度的升高可以筛选出胆固醇水平正常，但未来心血管病事件的高风险无症状者冠心病患者再发心血管事件的预测：当冠心病患者血清中hs-crp浓度每增加一个标准差时，发生非致命性心肌梗死的相对危险增加45％hs-crp可作为冠心病患者病情恶化及发生心梗危险的独立预报因子，提示可利用hs-crp来区分高危险和低危险患者。在ami和uap血液中hs-crp的含量：uap(7.28+/-2.03)mg/lami(22.19+/-7.64)mg/l正常组(2.35+/-0.58)mg/l炎症反应在acs的形成中所起的决定性作用已得到公认，hs-crp是急性冠脉事件发生的强有力的，独立的预测指标hs-crp的升高与炎症的活动相关，并与动脉硬化斑块的稳定状态相关，是高度敏感炎症指标。hs-crp对心血管炎症的评价：对不稳定性心绞痛，非q波型的心肌梗死患者，即使ctni未升高，但出现hs-crp的升高，相应的14天内病死率也会增加。对糖尿病患者在治疗过程中检测hs-crp，可以很好的预防急性心肌梗死的发生。当病情好转或治愈时，检测hs-crp的含量低时，则意味着预后较好。预测所有因素的死亡率：研究报道患者在入院时hs-crp浓度>5mg/l，则任何原因导致的死亡率均升高50％至330％不等，如入院时患者hs-crp浓度>8mg/l，死亡危险性成倍增加。作为一项独一无二的死亡危险性分选标志物，hs-crp应在患者入院时进行常规检测，并根据检测结果来分选出需要特别监护的高危患者。

3、正是基于crp的重要性，检测该指标变得尤为重要。目前市面上主要运用的方法分为三大类：1.免疫比浊测定法(散射，透射)此方法是运用抗原和抗体在反应液中反应后通过一束光照射到反应液中使之发生散射或是透射来测定蛋白浓度的一个过程。这种方法在于抗原和抗体是否充分反应，另外每个厂家的仪器的光源也有所不同所受因素比较大，免疫透射比浊法与免疫散射比浊法比较，免疫投射比浊法具有优良的精密度，相似的分析灵敏度和检测范围，良好的相关性，系统误差小，且更加实用和便利。2.标记免疫测定法(ria放射免疫检测法、酶标记免疫附测定法elisa)将抗原或抗体与酶结合作为探针，利用酶的活性来检查有无抗体或抗原而将放射免疫测定(ria)中的放射性标记用酶来代替的方法。因为不使用放射性物质，所以较为安全，只是灵敏度稍差，但由于在使用的酶的种类及结合方法等方面的改进，巳逐渐达到与ria大致相等的灵敏度。3.poct(免疫渗滤和免疫层析、酶标记、生物传感器、生物芯片)此种方法是最近今年发展较为迅速的一种快速检测方法。poct检测方法检测速度快只要几分钟就可以出具结果，操作简单，可用于床旁检测。但是目前针对crp可选择的单克隆抗体种类还不够丰富。

技术实现思路

1、本发明克服现有技术的缺陷，提供一种改进的crp单克隆抗体。

2、所述抗体为配对抗体，分别是6d2和7b12。

3、进一步的，6d2抗体的轻链可变区序列如seq id no：1所示，重链可变区序列如seqid no:2所示；7b12抗体的轻链可变区序列如seq id no：1所示，重链可变区序列如seq idno:2所示。

4、进一步的，在一些具体的实施方式中，所述重链可变区和轻链可变区为具有至少80％同一性或至多15个氨基酸差异的序列。

5、在一些具体的实施方式中，所述至少80％同一性优选为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；所述至多3个突变优选为至多3、2、1或0个突变；所述至多15个突变优选为至多15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个突变；优选地，所述突变为插入、缺失或替换，所述替换优选为保守氨基酸替换，所述突变优选为回复突变或热点突变。

6、本文术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异体(例如含有天然存在的突变或在制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。本文修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体或抗原结合分子。举例来说，单克隆抗体可通过多种技术制得，包括(但不限于)杂交瘤技术、重组dna方法、噬菌体库展示技术和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转殖基因动物的方法和其它本领域已知的方法。

7、进一步的，本发明的单克隆抗体还可以被可识别的标记进行标记。

8、进一步的，本发明还提供一种用于crp检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有特异性针对crp的单克隆抗体。

9、进一步的，本发明还提供了特异性针对crp的单克隆抗体在制备用于crp检测的试剂盒中的用途。

10、进一步的，本发明的试剂盒是elisa检测试剂盒。

11、所述elisa检测试剂盒还包含：包被抗体、酶标抗体、样品稀释液、10倍洗涤液、阴性对照、阳性对照、tmb底物溶液和终止液。

12、有益效果

13、本发明针对crp特异性的筛选和制备了crp单克隆抗体，通过筛选获得较好配对的酶标抗体以及包被抗体，二者组合使用制备得到了elisa双抗体夹心检测试剂盒，所述试剂盒能够用于crp的检测，所述试剂盒具有较好的特异性以及检测效果。