基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEB的引物、试剂盒与方法

基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的引物、试剂盒与方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的引物、试剂盒与方法。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌，隶属于葡萄球菌属，是一种常见的食源性病原菌。金黄色葡萄球菌抵抗外界不利因素的能力较强，因此在自然界中分布比较广泛，极易通过各种途径污染食品，并在适宜的环境下会分泌各种毒力因子，进而引发食物中毒，对人们的食品安全和健康造成重大威胁。绝大多数的金黄色葡萄球菌食物中毒都是由金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,ses)所引起的，目前发现最主要的金黄色葡萄球菌肠毒素主要有五种，分别是sea、seb、sec、sed和see。在食品安全的检测过程中seb经常被人们所忽视，具有重大的食品安全隐患，因此开发一种快速准确的检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的检测方法十分有必要。
3.目前检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的主要方法为免疫学方法、质谱分析方法和分子生物学方法。目前针对金黄色葡萄球菌肠毒素seb的免疫学方法具有成本高，准确性低以及操作复杂等缺点；质谱分析方法耗时长，需要精密的仪器，价格昂贵；分子生物学的方法主要是实时荧光定量pcr，该方法同样需要较高的成本和较长的检测时间。
4.聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction，psr)技术，是一种新兴的恒温扩增技术，仅需一对引物就可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，不需要任何的变温设备，因此成本低，操作简便，能够满足各种食品工厂与食品安全检测机构的需要，尤其适用于现场检测，在食源性病原菌的检测领域中有非常广阔的发展前景。因此建立一种针对金黄色葡萄球菌肠毒素seb的具有独立知识产权的聚合酶螺旋反应的检测方法具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的引物。
6.本发明的另一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的试剂盒。
7.本发明的再一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的的方法。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.一种基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的引物，包括检测引物ft和bt，其核苷酸序列如下所示：
10.检测引物ft:
[0011]5’‑
gtgacgagttaggtaatctcgggtatttgaagatgg-3’(seq id no.1)；
[0012]
检测引物bt：
[0013]5’‑
ctaatggattgagcagtgttcataaggcgagttgtt-3’(seq id no.2)。
[0014]
一种基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的试剂盒，包括上述基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的引物。
[0015]
所述的检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的试剂盒中，检测引物ft与bt的浓度均为50μm。
[0016]
所述的基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的试剂盒，还包括如下组分：
[0017]
a、2
×
反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(每种dntp的浓度均为10.0mm)；
[0018]
b、bst dna聚合酶；
[0019]
c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。
[0020]
组分b中所述的bst dna聚合酶的浓度为8u/μl。
[0021]
组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
[0022]
(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制浓度为50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制浓度为1mm的氯化锰水溶液；
[0023]
(ii)取25μl 50μm的钙黄绿素溶液与10μl 1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1:8)。
[0024]
所述的基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的引物或所述的基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的试剂盒在非疾病诊断目的的检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb中的应用。
[0025]
一种基于聚合酶螺旋反应检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的方法，包括如下步骤：
[0026]
(1)提取dna
[0027]
提取待检样品的细菌dna作为模板，并保证模板dna水溶液的od
260
/od
280
值为1.8～2.0；
[0028]
(2)聚合酶螺旋扩增反应
[0029]
于65℃水浴中保温60分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为(26μl反应体系)：2
×
反应缓冲液12.5μl，50μm的检测引物ft和50μm的检测引物bt各0.8μl，dna模板2.0μl，8u/μl的bst dna聚合酶1.0μl，去离子水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；所述的检测引物ft的核苷酸序列如seq id no.1所示，检测引物bt的核苷酸序列如seq id no.2所示；
[0030]
(3)判断
[0031]
①
待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如反应液颜色为橙色，说明待检样品中不含金黄色葡萄球菌肠毒素seb；如反应液颜色变为绿色，说明待检样品中含有金黄色葡萄球菌肠毒素seb；
[0032]
和/或
[0033]
②
待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后取反应液进行琼脂糖凝
胶电泳，若电泳结果无条带，说明待检样品中不含金黄色葡萄球菌肠毒素seb；若电泳结果呈梯形条带，说明待测样品中含有金黄色葡萄球菌肠毒素seb。
[0034]
步骤(2)中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
[0035]
(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mm的氯化锰水溶液；
[0036]
(ii)取25μl 5 0μm的钙黄绿素溶液与10μl 1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
[0037]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0038]
(1)本发明中所提供的针对金黄色葡萄球菌肠毒素seb特异性靶序列所设计的聚合酶螺旋检测鉴定体系，解决现有技术中的方法检测时间长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。
[0039]
(2)本发明在等温条件下扩增，不会因为变温而耗费大量的时间，反应迅速、所需时间短，在60分钟就可完成获得检测结果，同传统环介导等温扩增技术相比也缩短了检测周期，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义，给实现便捷、准确的现场检测提供了一种思路。
[0040]
(3)本发明方法不需要特殊、昂贵的仪器和，甚至可以不需要进行凝胶电泳，直接用荧光染料(钙黄绿素和氯化锰混合溶液)进行显色，可凭肉眼判断检测结果，操作简便快捷，检测成本较低，具有灵敏度高、特异好的优点。
[0041]
(4)本发明提供了针对金黄色葡萄球菌肠毒素seb的特异性靶序列保守区的特异区域设计了一对检测引物，从而保证了检测结果的可靠性，特别适用中小型食品企业的产品检测及现场检测。
附图说明
[0042]
图1为本发明基于聚合酶螺旋反应技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的显色结果图(图中，1：金黄色葡萄球菌mrsa 132115；2：金黄色葡萄球菌mrsa 0315022822；3：金黄色葡萄球菌mrsa 0613120003；4：金黄色葡萄球菌mrsa 0314020129；5：金黄色葡萄球菌mrsa 0315011480；6：沙门氏菌atcc29629；7：沙门氏菌atcc19585；8：沙门氏菌atcc14028；9：沙门氏菌atcc13076；10：沙门氏菌atcc12176；11：单增李斯特菌atcc19116；12：单增李斯特菌atcc19114，13：单增李斯特菌atcc19115；14：单增李斯特菌atcc15313；15：单增李斯特菌atcc19113；16：铜绿假单胞菌atcc27853；17：大肠杆菌atcc43895；18：大肠杆菌e020；19:大肠杆菌e043；20：大肠杆菌e044；21：副溶血性弧菌atcc17802；22：副溶血性弧菌atcc27969；23：干酪乳杆菌bm-lc14617；24：阴性对照)。
[0043]
图2为本发明基于聚合酶螺旋反应技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的琼脂糖凝胶电泳图(图中，泳道1：金黄色葡萄球菌mrsa 132115；泳道2：金黄色葡萄球菌mrsa 0315022822；泳道3：金黄色葡萄球菌mrsa 0613120003；泳道4：金黄色葡萄球菌mrsa 0314020129；泳道5：金黄色葡萄球菌mrsa0315011480；泳道6：沙门氏菌atcc29629；泳道7：沙门氏菌atcc19585；泳道8：沙门氏菌atcc14028；泳道9：沙门氏菌atcc13076；泳道10：沙门氏菌atcc12176；泳道11：单增李斯特菌atcc19116；泳道12：单增李斯特菌atcc19114，泳道13：单增李斯特菌atcc19115；泳道14：单增李斯特菌atcc15313；泳道15：单增李斯特菌
atcc19113；泳道16：铜绿假单胞菌atcc27853；泳道17：大肠杆菌atcc43895；泳道18：大肠杆菌e020；泳道19:大肠杆菌e043；泳道20：大肠杆菌e044；泳道21：副溶血性弧菌atcc17802；泳道22：副溶血性弧菌atcc27969；泳道23：干酪乳杆菌bm-lc14617；泳道24：阴性对照)。
[0044]
图3为敏感性检测实验结果图；其中，a为琼脂糖凝胶电泳结果(图中，泳道m：dna marker；泳道1：63ng/μl；泳道2：6.3ng/μl；泳道3：630pg/μl；泳道4：63pg/μl；泳道5：6.3pg/μl；泳道6：630fg/μl；泳道7：63fg/μl；泳道ng：阴性对照)；b为显色结果(图中，1：63ng/μl；2：6.3ng/μl；3：630pg/μl；4：63pg/μl；5：6.3pg/μl；6：630fg/μl；7：63fg/μl；8：阴性对照)。
具体实施方式
[0045]
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂、材料和菌株均可通过市售获得。
[0046]
实施例1
[0047]
设计一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的引物，具体设计方法如下：
[0048]
(1)在genbank上搜索该检测对象(本专利申请为金黄色葡萄球菌)的全部基因组序列(15029个)，筛选携带肠毒素seb的基因序列；
[0049]
(2)在genbank上搜索seb基因序列(2808个)，并应用clustalw软件进行alignment分析，通过不同序列间进行多重比对，获得最高保守度的区域序列；
[0050]
(3)进一步应用mauve等软件对所获得的区域序列进行分析，同时结合该序列所使用的测序平台与方法，进行综合容错度分析，例如sanger测序方法存在前20-30和后20-30个碱基序列可信度较低，可通过两端通测等方式进行排除；例如pacbio测序则存在碱基错对现象，可通过illumina或sanger测序等进行校对；通过以上综合分析，可进一步对序列容错度进行精确判断，从而获得seb中的高保守区域序列。通过上述分析，发现seb中最高保守度区域(seq id no.7)，并用于此进行引物设计。
[0051]
获得的保守区域核苷酸序列如下(seq id no.7)：
[0052]
tctacacccaacgttttagcagagagtcaaccagatcctaaaccagatgagttgcacaaagcgagtaaattcactggtttgatggaaaatatgaaagttttgtatgatgataatcatgtatcagcaataaacgttaaatctatagatcaatttctatactttgacttaatatattctattaaggacactaagttagggaattatgataatgttcgagtcgaatttaaaaacaaagatttagctgataaatacaaagataaatacgtagatgtgtttggagctaattattactatcaatgttatttttctaaaaaaacgaatgatattaattcacatcaaactgacaaacgaaaaacttgtatgtatggtggtgtaactgagcataatggaaaccaattagataaatatagaagtattactgttcgggtatttgaagatggtaaaaatttattatcttttgacgtacaaactaataagaaaaaagtgactgctcaagaattagattacctaactcgtcactatttggtgaaaaataaaaaactctatgaatttaacaactcgccttatgaaacgggatatattaaatttatagaaagtgagaatagcttttggtatgacatgatgcctgcaccaggagataaatttgaccaatctaaatatttaatgatgtacaatga。
[0053]
(4)根据聚合酶螺旋反应(psr)的扩增反应原理，使用primer premier软件针对靶点seb保守区域设计引物了3套引物，包括正向引物(ft)和反向引物(bt)，其中正向引物
lc14617。去核酸水为阴性对照。
[0068]
上述五株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa 132115，mrsa 0315022822，mrsa 0613120003，mrsa 0314020129和mrsa 0315011480购自广州肽谷科技有限公司；大肠杆菌e020、大肠杆菌e043和大肠杆菌e044可参考文献(周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌vbnc状态的诱导及毒素表达量的影响研究[d].华南理工大学,2015.)获得；干酪乳杆菌bm-lc14617可参考文献(junyan liu,lin li,bing li,brian m.peters,yang deng*,zhenbo xu*,mark e.shirtliff.the viable but nonculturable state induction and genomic analyses of lactobacillus casei bm-lc14617,a beer-spoilage bacterium.microbiologyopen.2017；e506.)获得。
[0069]
采用dna提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od
260
/od
280
的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。
[0070]
(2)金黄色葡萄球菌肠毒素seb的聚合酶螺旋扩增反应：在反应管中配制总体积为26μl的聚合酶螺旋扩增反应体系；加入2
×
反应储液12.5μl，检测引物ft与bt等体积混合引物混合液1.6μl，bst dna 聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补充体积至25μl；最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μl，混匀即可。此时各物质浓度为：tris-hcl 20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween 20 0.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps 1.4mm，bst dna聚合酶8u，检测引物ft、bt各1.6μm。将反应管置于65℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。
[0071]
(3)显色检测：待反应结束后，用肉眼观察颜色变化
[0072]
结果如图1所示：结果显示:对照组的颜色为橙色，说明检测菌株不含有金黄色葡萄球菌肠毒素seb基因；实验组的颜色均变为绿色，说明含有金黄色葡萄球菌肠毒素seb基因。随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致(图2)。
[0073]
实施例3 psr检测金黄色葡萄球菌肠毒素seb的敏感性试验
[0074]
将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa 132115的基因组进行10倍浓度梯度稀释，稀释后浓度分别为63ng/μl，6.3ng/μl，630pg/μl，63pg/μl，6.3pg/μl，630fg/μl，63fg/μl，同时设置阴性对照(去离子水)，按照上述实施例2中的反应体系构建聚合酶螺旋反应扩增方法，以确定检测方法的敏感性。
[0075]
结果如图3所示：结果表明建立的金黄色葡萄球菌肠毒素seb聚合酶螺旋反应方法可检测样品中63pg/μl的金黄色葡萄球菌dna。
[0076]
结论
[0077]
从上述实验结果可以看出，聚合酶螺旋反应扩增方法相较于常规pcr和荧光pcr具有如下优点：
[0078]
操作简便，鉴定方便：常规pcr整个过程需要大约在2～4小时，荧光定量pcr也需要1.2～1.5小时，本发明所提供的检测方法在60分钟就可以得到检测结果。并且不需要昂贵的仪器，可以在条件简陋的情况下完成整个检测的过程，只需要一个水浴锅来控制反应温度，不需要任何的变温设备，完全可以满足现场检测的需要，在快速检测领域具有非常广阔的应用市场。
[0079]
特异性强：通过扩增反应是否发生来判断待检样品是否含有具有特异性的靶点基因，从而完成了细菌的定性检测。
[0080]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。