一种微生物铁载体的生产、分离和富集工艺及设备

本发明属于微生物领域，具体涉及一种微生物铁载体的生产、分离和富集工艺及设备。

背景技术：

1、铁载体是微生物在缺铁环境下产生的一种对铁具有高亲和力的低分子量金属螯合剂，铁载体与环境中的fe3+或fe2+结合形成的配合物通过细胞的主动运输进入微生物和植物体内，从而促进微生物和植物对铁素的吸收利用。铁载体还能与多种重金属元素（如cd、cr、cu、pb、zn等）鳌和降低其生物可利用性，可作为一种高效、环保的重金属污染土壤修复剂。此外，铁载体还能通过抑制病原微生物的生长而提升植物的抗病能力，能有效防范植物病虫害，提高农作物产量。因此，微生物铁载体制剂能在农业生产和环境污染防治等方面具有应用潜力。

2、微生物铁载体制剂可以根据不同使用途径选择合适的制备方法。现有的的制备方法主要包括分离后直接使用和利用载体（如生物炭、多孔树脂等）对铁载体进行富集浓缩后使用两种方法。中国专利（cn114903049a）公开利用枯草芽孢杆菌生产儿茶酚型铁载体并将铁载体分离后制成液相铁载体制剂用于阻控稻田中镉向水稻籽粒的迁移转化。中国专利（cn111848734b）利用多孔树脂hp20对铁载体进行分离和富集，并经过洗脱、浓缩后获得具有荧光特性的铁载体pvd。但目前还没有用于铁载体制剂规模化生产的工艺及设备，提供简单便利、成本低廉的微生物铁载体制剂制备方法则是推动铁载体制剂大规模应用的关键。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种微生物铁载体的生产、分离和富集工艺；本发明的第二目的在于提供一种微生物铁载体的生产、分离和富集设备；本发明的第一目的是这样实现的，包括以下步骤：

2、（1）配制培养基：按比例称取原料，并加无菌水混合得到液体培养基，使用的培养基为缺铁的msm培养基;

3、（2）灭菌：对步骤（1）得到的液体培养基进行高压蒸汽121℃、15~20min灭菌处理后移至无菌室，冷却后分别转移到灭菌处理后的装置培养室和培养瓶中；

4、（3）培育种子液：在无菌室内使用无菌接种环轻划lb固体培养基上的微生物群落转移至培养瓶内，使用无菌透气膜封口，放入无菌恒温振荡培养箱内培养96~120 h得到种子液；

5、（4）接种发酵：在封闭无菌环境下进行接种，将步骤（3）得到的种子液倒入装有灭菌液体培养液的培养室（8）中发酵培养，发酵96~120 h后，取少量发酵菌液与等体积cas检测液混合，cas检测出现明显蓝色褪色反应时停止发酵，发酵完成后得到初始菌液；

6、（5）离心分离：对步骤（4）得到的初始菌液进行离心分离，在离心装置80000~120000 rpm转速下，微生物菌体与培养液分离，得到富含铁载体的上清液；

7、（6）富集：步骤（5）得到的上清液进行富集，利用负载材料（生物炭或多孔树脂）的高比表面积特性对上清液中的铁载体进行吸附富集，上清液与负载填料充分接触循环富集3~4h，即得所述微生物铁载体制剂。

8、进一步的，所述培养的微生物为枯草芽孢杆菌（ bacillus subtills），是一种铁载体高产细菌，产出的微生物铁载体种类为儿茶酚型铁载体。

9、进一步的，所述培养基为缺铁的msm培养基，主要成分及浓度：乙酸钠7g/l、磷酸二氢钾0.1g/l、硫酸铵0.5g/l、硝酸钠0.5g/l、氯化钙0.02g/l、硫酸镁0.02g/l，ph 7.0，缺铁环境能促进微生物高效分泌铁载体。

10、进一步的，步骤（3）和步骤（4）所述培养条件，温度保持30℃，搅拌速度为180 rpm。

11、进一步的，步骤（6）使用的负载填料为生物炭或多孔树脂，生物炭/上清液的固液体积比为1:1~1.5:1，多孔树脂/上清液的固液体积比为2:1~3:1。

12、本发明的第二目的是这样实现的，一种微生物铁载体生产、分离和富集设备，包括包括主体、生产分离层和富集层，所述主体下方设置有底座（19），所述主体内部从上至下依次设置生产分离层和富集层，在生产分离层完成微生物的培养和铁载体的分离，在富集层完成铁载体的富集浓缩；具体包括电机（1），支撑架（2），电动伸缩杆（3）、搅拌扇叶（4），培养基入料口（5），保温层（6），离心装置（7），培养室（8），出料口（9），上清液管道（10），雾化喷头（11），填料入口（12），循环管道（13），滤网（14），液泵（15），富集室（16），螺旋搅拌装置（17），填料出口（18），底座（19）。

13、进一步的，所述生产分离层包括电机（1），支撑架（2），电动伸缩杆（3）、搅拌扇叶（4），培养基入料口（5），保温层（6），离心装置（7），培养室（8），出料口（9），所述电机（1）设置在主体顶部，所述电机（1）通过电动伸缩杆（3）连接搅拌扇叶（4），所述支撑架（2）一侧固定在主体上，另一侧连接电动伸缩杆（3），所述保温层（6）设置在主体内侧，所述培养室（8）顶部设有培养基入料口（5），底部设有出料口（9），所述培养室（8）内部还设有离心装置（7），在生产分离层完成微生物的培养和铁载体的分离。

14、进一步的，所述富集层包括上清液管道（10），雾化喷头（11），填料入口（12），循环管道（13），滤网（14），液泵（15），富集室（16），螺旋搅拌装置（17），填料出口（18），所述上清液管道（10）一端连接培养室（8）用于上清液的排出，所述上清液管道（10）上设置有若干雾化喷头（11），所述富集室（16）上部设置有填料入口（12），下部设有填料出口（18），所述富集室（16）下部与填料出口（18）齐平的位置水平设有滤网（14），所述循环管道（13）的另一端连通至富集室（16）底部，所述循环管道（13）上设有液泵（15），所述培养分离层的上清液管道（10）与富集层的循环管道（13）独立，各自在富集室顶部（16）设置有雾化喷头（11）；在富集层完成对铁载体的富集浓缩。

15、进一步的，所述电机（1），支撑架（2），电动伸缩杆（3）、搅拌扇叶（4）组成可升降搅拌装置，在微生物培养过程中，电动伸缩杆（3）伸长，电机（1）通过内置齿轮带动搅拌扇叶转动，使微生物充分利用培养基营养物质；在离心过程中，电动伸缩杆（3）收缩，减少离心时的阻力；支撑架（2）对电动伸缩杆（3）、搅拌扇叶（4）起到支撑作用，减少工作时的晃动。

16、进一步的，所述保温层（6）内置电热装置、温度传感器和plc控制器，温度传感器将温度传至plc控制器，当温度低于预设值时，由plc控制器控制电热装置启动并工作升温，当温度高于预设值时，由plc控制器控制电热装置停止工作，实现培养室内温度的自动控制，保温层其余部位填充聚氨酯，增强保温效果。

17、进一步的，所述滤网（14）材质为不锈钢，孔径为10 μm。

18、进一步的，所述循环管道（13）、液泵（15）组成上清液循环系统，流至富集室底部上清液通过滤网（14）进入循环管道（13），由液泵（15）推动回流进入富集室；使负载材料充分吸附上清液中铁载体，提高负载率。

19、本发明的工作原理和工作过程：培养基入料口（5）投入缺铁msm培养基和种子液进入培养室（8），发酵过程中电机机（1）通过内置齿轮带动搅拌扇叶转动，使微生物充分利用培养基营养物质，保温层（6）内的温度传感器、plc控制器和电热装置使培养室温度保持在30℃，发酵96~120 h后，电动伸缩杆（3），离心装置（7）启动使菌体与上清液分离，上清液通过上清液管道（10）由雾化喷头（11）均匀喷洒在富集室（16）中的负载材料上（生物炭或多孔树脂），利用负载材料高表面积特性吸附上清液中铁载体，螺旋搅拌装置（17）的搅拌和循环管道（13）、液泵（15）对上清液的循环使上清液与负载材料充分接触，循环富集3~4 h，得到铁载体制剂。

20、本发明的有益效果是：

21、1、本发明利用微生物生产铁载体并可实现微生物铁载体的生产、分离和富集一体化，获得的铁载体制剂可用于农业生产和环境污染防治等活动。

22、2、本发明根据微生物分泌铁载体和负载材料吸附机制，通过微生物培养条件（包括ph值、温度、营养组分、培养时间）和富集工艺的优化（包括负载材料的种类、固液比、富集时间）高效生产铁载体制剂。