一种调控真菌生长的胞外蛋白CFEM85及其应用

no：2所示。
7.一种金龟子绿僵菌cfem85敲除菌株。
8.所述金龟子绿僵菌cfem85敲除菌株在提高杀虫毒力中的应用。
9.所述虫为家蚕、大蜡螟或桃蚜。
10.一种金龟子绿僵菌cfem85敲除菌株的构建方法，按照如下步骤进行：
11.(1)以金龟子绿僵菌潮霉素敏感菌株ma9-41为野生菌株样本，从该绿僵菌基因组dna中克隆得到了cfem85前后同源臂基因，从pkh-ko载体上克隆得到包含启动子序列的潮霉素基因；
12.(2)通过overlap pcr构建敲除盒，利用peg介导原生质体转化，得到了转化后的原生质体再生物，经过潮霉素梯度筛选，获得转化子，随后转化子pcr验证得到了金龟子绿僵菌cfem85敲除菌株。
13.本发明的有益效果：本发明在金龟子绿僵菌上敲除cfem85基因，获得了一个绿僵菌突变株，初步验证了cfem85基因在维持绿僵菌生理特性中的作用，为后续对该蛋白功能研究和利用提供参考，此外，由于其突变株对昆虫的侵染速度加快，其菌株可作为一种生物材料，对推进昆虫病原真菌绿色防控。
附图说明
14.图1为敲除盒构建步骤。
15.图2为潮霉素基因以及绿僵菌cfem85基因前后同源臂扩增；
16.图中，m:dna marker；左图泳道1:hyg；右图泳道1:s1；2:s2。
17.图3为cfem85基因敲除突变株验证；
18.图中，a:cfem85基因的基因组dna验证；b:hyg基因的基因组dna验证；c：cfem85基因的cdna验证。
19.图4为绿僵菌野生株(wt)与敲除株(δcfem85)的孢子萌发率(a)菌丝长度(b)产孢量(c)比较。
20.图5为绿僵菌野生株(wt)与敲除株(δcfem85)对绿僵菌耐热性(左图)和抗紫外胁迫的影响(右图)。
21.图6为绿僵菌野生株(wt)与敲除株(δcfem85)在不同耐胁条件下的萌发率。
22.图7为绿僵菌野生株(wt)与敲除株(δcfem85)在不同耐胁条件下的菌落生长情况。
23.图8为绿僵菌野生株(wt)与敲除株(δcfem85)对三种试虫的毒力测定。
具体实施方式
24.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
25.下述实施例供试生物材料：金龟子绿僵菌(metarhizium anisopliae)ma9菌株为本实验室保存的潮霉素敏感菌株，pday为适用培养基，28℃培养箱恒温倒置培养，于第十天收集孢子粉用于后续实验。家蚕(bombyx mori)3龄幼虫，山东青州广通蚕农场室内饲养，25
℃，相对湿度50％，光暗比16h:8h。大蜡螟，3龄幼虫，由天津惠裕德生物科技有限公司提供,25℃，相对湿度20％。用于菌株生物测定。桃蚜，河南全应生物有限公司提供，200头成虫饲养三天，取龄期一致的若蚜进行实验。
26.基因敲除载体pkh-ko含带有启动子序列的潮霉素抗性基因hyg。该载体由中国农业科学院植物保护研究所李梅研究员惠赠。
27.实施例1绿僵菌cfem85敲除株的构建
28.真菌菌丝的培养和总dna提取：将新培养的孢子用0.05％的无菌tween-80配制成孢子悬浮液，通过血球计数板计数后吸取适量接种于200ml产菌丝培养基(1000ml中含硫酸镁2g，蔗糖20g，酵母粉10g，磷酸氢二钾5g)，至终浓度1
×
106spores/ml，28℃培养3d。菌丝通过真空泵抽滤，并用100ml无菌水淋洗2次，抽干后收集菌丝体，放入液氮中速冻。利用plant genomic dna purification kit试剂盒(genemark生物技术有限公司)提取绿僵菌的基因组dna。
29.表1载体构建及目标片段特异性引物
[0030][0031]
潮霉素基因hyg和cfem85基因前后同源臂的克隆：设计的5对特异性引物见表1。以引物对cfem85 s1-f/r、cfem85 s2-f/r分别对ma9基因组dna进行pcr扩增；以引物对hyg-f/r对载体pkh-ko进行pcr扩增。依照takara公司pcr高保真扩增酶说明书配制反应体系，反应温度为95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃1min，4℃保温，循环35次。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用pcr产物纯化回收试剂盒(biomed公司)回收，获得同源前臂s1、同源后臂s2和带启动子ptrpc序列的潮霉素基因hyg。参考徐芳(徐芳et al.2006)(2006)使用overlap pcr进行序列拼接，最终获得cfem85同源前臂与潮霉素连接片段s1h，cfem85同源后臂与潮霉素连接片段s2h(图1)。
[0032]
利用特异性引物cfem85 s1-f/r扩增得到了928bp的cfem85同源前臂基因序列s1，利用引物cfem85 s2-f/r扩增得到了1154bp的cfem85同源后臂基因序列s2(图2a)，利用潮霉素引物hyg-f/r扩增得到了含有ptrpc启动子的hygromycin潮霉素基因片段，共1426bp(图2b)。通过overlap pcr，利用cfem85 s1-f与hyg s1-r引物将928bp s1基因与945bp潮霉素前端序列相连，获得s1h；利用hyg s2-f与cfem85 s2-r 1154bp s2与潮霉素后936bp序列相连，获得s2h序列(图2c)。
[0033]
敲除盒转化绿僵菌原生质体：
[0034]
菌丝体培养：接种金龟子绿僵菌ma9孢子悬浮液1
×
108孢子于100ml产菌丝培养基中，27℃、180r/min振荡培养20h，得幼嫩菌丝体。用miracloth滤布(22-25μm，北京诺博莱德科技有限公司)过滤，用10ml 0.7m的nacl溶液冲洗3次，收集菌丝。
[0035]
菌丝的酶解：取0.1g湿菌丝置于50ml的离心管中，加入20ml用0.7m nacl配制的0.2％lysing enzyme for(北京博奥拓达科技有限公司)，于30℃、80rpm/min解离3h。用miracloth过滤除去残余菌丝，得到原生质体，并用20-30ml 0.7m的nacl溶液清洗两次。用stc缓冲液(蔗糖200g，1m tris-hcl(ph 8.0)50ml，cacl
2 5.55g，加ddh2o定容至1000ml)重悬、离心清洗两次，将原生质体悬于600μl stc buffer中，显微镜下计数，调终浓度至2-5
×
107个/ml。
[0036]
原生质体转化及转化子检验：参照王晓玲等(王晓玲,蒋伶活and安徽农业科学2007)(2007)cac1
2-peg介导原生质体转化法，将敲除盒s1h、s2h加入绿僵菌ma9原生质体，与40％ peg 8000混合后在28℃孵育20min。然后涂布在含低熔点琼脂糖的tb3(yeast extract 3g,casamino acids 3g，蔗糖200g，蒸馏水定容至1000ml)固体培养基(含amp浓度100μg/ml，潮霉素浓度300μg/ml)上，28℃恒温培养3d，获得菌落为假定转化子。
[0037]
参照上述方法提取转化子基因组dna，以潮霉素引物hyg-f/r，及cfem85敲除验证引物out-cfem85-f/r进行pcr检验，判断确定转化成功的同源重组子，即cfem85敲除株。
[0038]
通过cac1
2-peg介导，将扩增得到的cfem85基因同源臂敲除盒s1h、s2h片段转化绿僵菌原生质体，原生质体再生后获得了转化子。挑选转化子在潮霉素平板上转接三代，提取转化子的基因组dna，利用out-cfem85-f/r和hyg-f/r对转化子进行验证，结果显示有5个阳性转化子成功扩增hyg基因(图3b)，但未扩增出cfem85基因(图3a)，表明cfem85敲除成功。同时以5株阳性转化子的cdna为模板，扩增cfem85基因(图3c)，进一步验证cfem85基因敲除成功，后续选取1-22号转化子进行实验。
[0039]
实施例2cfem85敲除株的生物学测定
[0040]
孢子萌发率，生长速率和产孢量测定：分别取30ul wt和cfem85敲除株1x107个/ml的孢子悬液，均匀涂布于萌发培养基(1000ml中含有0.1％葡萄糖，0.05％蛋白胨，2％琼脂粉)平板上，于28℃恒温箱中倒置培养。从第2.5小时开始每隔2.5h连续至12.5h止，用灭菌刀片在每个培养皿上切面积约1cm2小块置于载玻片上，用光学显微镜随机观察100个孢子的萌发情况。判断萌发标准：孢子上的凸起长度大于孢子本身的一半。每组实验独立重复3次。计算并统计孢子萌发的情况。
[0041]
萌发率＝萌发的孢子数/总孢子数
×
100％。
[0042]
生长速率及产孢量测定：参照蔡守平等的方法并加以改善。将活化的绿僵菌野生株ma9、敲除株δcfem85的分生孢子用0.1％的吐温-80配成1.0
×
107孢/ml的悬浮液，于pday平板中央放置直径为5mm的灭菌滤纸，用微量移液器分别点滴接种5μl孢子悬浮液于滤纸上，晾干后置28℃恒温箱中倒置培养，各重复5次。从3d后开始，每天用电子数显卡尺测量1次菌落直径，按十字交叉测量后取其平均值，观察测量至11d共9次，比较敲除菌株和野生株的菌落生长速度。待培养12d后菌落表面完全覆盖分生孢子，用直径5mm的打孔器在菌落半径上距离菌落中心1/2处打取菌饼，每菌落按十字对称取4个菌饼，置于定量的0.1％的吐温-80无菌水中，振荡使孢子充分分散。用血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量，各菌株重复测定5次。
[0043]
敲除株与野生株在5h开始出现萌发(萌发率》10％)，但两者之间的萌发率无显著的差异，培养第7.5h时，敲除株的的萌发率达到85％，显著高出野生株16.8％(p《0.01)，但培养到10h和12.5h时，两者之间的萌发率无显著差异，均高于90％(图4a)。对野生株ma9与δcfem85在pday培养基上生长3～10d的菌落直径分析显示，敲除株与野生株相比，菌丝生长速率显著低于野生株(图4b)。对于产孢量，在培养第12天，野生株wt产孢量为(4.49
±
0.15)
×
105孢子/mm2，而敲除株δcfem85产孢量为(2.99
±
0.19)
×
105孢子/cm2，相较于野生株显著下降了33.33％，表明δcfem85的缺失影响了绿僵菌的产孢(图4c)。
[0044]
湿热耐热性测定：分别取wt和cfem85敲除株1.0
×
107个/ml的孢悬液30μl，均匀涂布于萌发培养基平板上，45℃恒温干燥箱中下分别热激0min、30min、60min、90min、120min后，于28℃恒温箱中倒置培养，20h后测定萌发率，每组实验独立重复3次。
[0045]
比较敲除株与野生株的耐热性发现，45℃热激处理0min和30min，各菌株的萌发率无显著差异，但随着处理时间的增加，与wt相比，δcfem85的萌发率持续降低；处理60min后，δcfem85的萌发率相比wt降低约16％；90min时，δcfem85的萌发率相比wt降低约58.7％；热激120min时，δcfem85的萌发率相比wt降低约52.3％(图5左)。由此可知，cfem85基因缺失降低了绿僵菌的耐热性。
[0046]
抗紫外能力测定：别取wt和cfem85敲除株1.0
×
107个/ml的孢悬液30μl，均匀涂布于萌发培养基平板上，然后打开培养皿盖子，将平板放在紫外灯下照射0min、5min、15min、30min、60min，再盖上盖子后放人28℃恒温箱中倒置培养，20h后测萌发率，每组实验独立重复3次。
[0047]
比较敲除株与野生株的耐紫外胁迫性发现，uv-b处理0min，各菌株的萌发率无显著差异，但随着处理时间的增加，与wt相比，δcfem85的萌发率显著降低；处理5min后，δcfem85的萌发率相比wt降低了约39.4％；紫外处理15min和30min时，与wt相比，δcfem85的萌发率分别下降了为52％和36.4％。当uv-b处理60min时，野生株和敲除株的萌发率均小于10％，但两者之间无显著差异(图5右)。由此可知，cfem85基因缺失降低了绿僵菌菌株的抗紫外能力。
[0048]
渗透压耐受力测定：分别取wt和cfem85敲除株1.0
×
107个/ml的孢悬液30μl，分别涂布于高渗透压条件的pda平板上，培养基中分别添加1mol/l甘露醇(mannitol)、1mol/l山梨醇(sorbitol)，0.5mol/l nacl，3mgl/ml刚果红，2.5μg/ml sds作为高渗透压逆境条件，于28℃恒温箱中倒置培养，分别在12h萌发率，每组实验独立重复3次。同时，野生株ma9、敲除株δcfem85的分生孢子用0.1％的吐温-80配成1.0
×
107孢/ml的悬浮液，于各渗透压条件的pda平板中央放置直径为5mm的灭菌滤纸，用微量移液器分别点滴接种5μl孢子悬浮液于滤纸上，晾干后置28℃恒温箱中倒置培养，各重复3次，与第5天测量其菌落直径。
[0049]
比较野生株与敲除株在高渗透压胁迫下的萌发率发现，除山梨醇胁迫下两者之间的萌发率无显著差异，1mol/l甘露醇处理下，3mg/ml刚果红，2.5μg/ml sds，0.5mol/l nacl处理下，敲除株在12h的萌发率均显著低于野生株，且刚果红对绿僵菌的生长影响最大，敲除株与野生株的萌发率均低于60％，且敲除株的萌发率相对于野生株下降了13.9％。sds，甘露醇，nacl胁迫下，敲除株相较于野生株，萌发率分别下降14.9％，8.7％，19.5％(图6)。
[0050]
比较野生株与敲除株在高渗透压胁迫下的菌落生长情况发现，山梨醇和nacl胁迫下敲除株与野生株的菌落大小无显著差异，而刚果红，sds，甘露醇胁迫下，敲除株的菌落直
径均显著小于野生株(图7)。
[0051]
毒力测定：将三龄初的家蚕，大蜡螟以及桃蚜若虫随机分配至无菌的生测盒中，每盒15头，每个处理五个重复。分别收集同一时间培养的野生菌株孢子粉与δcfem85突变株孢子粉，悬浮于无菌的0.05％的tween-80水中，显微计数后将孢子浓度调整至1
×
108spores/ml。将喷雾塔(burkard potter precision laboratory)气压调整至80kpa，用0.05％的吐温水清洗三次，每次5ml。每框试虫喷菌3ml，空白对照(control-0.05％ tween)喷洒3ml无菌的0.05％的tween-80。半小时后，每框加入桑叶20g。每天记录家蚕死亡数，连续记录9天，计算每天死亡率，并绘制死亡率柱状图。
[0052]
生物测定显示，敲除株(δcfem85)、野生株(wt)对家蚕，大蜡螟，和桃蚜均有较高毒力，且敲除株的毒力略高于野生株。
[0053]
与空白对照相比，家蚕在处理后的第6天敲除株的死亡率即出现显著差异，但野生株与对照无显著差异；大蜡螟的死亡率均在野生株和敲除株处理后第6天与空白对照相比出现显著差异；桃蚜在敲除株处理后第4天死亡率与空白对照相比即出现显著差异，在野生株处理后的第5天的与空白对照相比有显著差异。
[0054]
三种试虫的死亡率均逐日攀升，在家蚕生测组中，处理后第8天开始，wt和δcfem85之间的死亡率出现显著差异，与野生株相比，敲除株的死亡中时间lt50为8.17天，较野生株提前了1.97天，wt第9天死亡率为41.3％，δcfem85最终死亡率为54.6％；大蜡螟处理组中，处理后第6天开始，wt和δcfem85之间的死亡率出现显著差异，与野生株相比，敲除株的死亡中时间lt50为7.2天，较野生株提前了3.1天，wt第9天死亡率为41.3％，δcfem85最终死亡率为66.6％；桃蚜处理处理组中，处理后第5天开始，wt和δcfem85之间的死亡率出现显著差异，与野生株相比，敲除株的死亡中时间lt50为4.91天，较野生株提前了1.29天，wt第7天死亡率为62.7％，δcfem85最终死亡率为82.7％(图8)。以上表明cfem85基因的敲除后提高了绿僵菌的毒力。
[0055]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。