一种用于提高多发性骨髓瘤患者的DC细胞活性的培养基及其培养方法

一种用于提高多发性骨髓瘤患者的dc细胞活性的培养基及其培养方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种提高多发性骨髓瘤患者的dc细胞活性的细胞培养基及培养方法。


背景技术：

2.多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)为浆细胞来源的恶性肿瘤，目前发病率高居血液系统恶性肿瘤第二位，至今仍不可治愈，患者终将面对疾病复发。mm发病与染色体的缺失、基因异常表达、免疫微环境改变等密切相关，且在疾病早期就已经出现免疫紊乱。由此，以提升患者自体抗骨髓瘤免疫力的免疫治疗策略，可以通过提升机体免疫监视、免疫活化、免疫杀伤效应，而有效清除体内癌细胞，甚至达到彻底治愈的目的。
3.而树突状细胞(dendritic cell,dc)在启动机体抗肿瘤免疫应答中起着关键作用，dc细胞作为最重要的抗原递呈细胞，通过递呈mhc分子以及肿瘤抗原给初始t细胞识别、同时提供t细胞活化所需的共刺激信号，并促进th细胞以及细胞毒性t淋巴细胞的分化增殖，从而为启动机体特异性抗肿瘤免疫应答最为关键的第一步。
4.研究显示，mm患者表现为显著的免疫缺陷，其中患者体内严重免疫缺陷的dc细胞为特异性抗肿瘤免疫力不能被正常、有效激活的主要原因之一，导致疾病的发生发展。由此，逆转患者体内dc细胞的严重免疫缺陷状态，恢复或提升患者dc细胞活性及成熟度，为亟待解决的关键问题之一。
5.因此，体外培养、诱导形成mm患者自体来源的dc细胞并显著增强其活性及成熟度，之后将其dc细胞回输至患者体内的免疫治疗策略为近年来国内外研究的前沿热点方向，具有良好的研究及转化应用前景。
6.现有的常规体外培养、诱导形成dc细胞的方法一般为：从外周血中分离出外周血单个核细胞(pbmcs)，将pbmcs在1640培养基、5vol％人血清、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素组成的培养基中，于37℃、5vol％co2环境中培养24小时，以使其中dc前体细胞(单核细胞)黏附、贴壁。其后洗去、弃去未黏附贴壁的细胞，将dc前体细胞在1640培养基、5vol％人血清、800u/ml gm-csf、500u/ml il-4、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素组成的培养基中，于37℃、5vol％co2环境中培养7天，以诱导形成dc细胞，其后收获dc细胞。
7.当前体外培养诱导形成mm患者自体来源dc并将其回输患者体内的免疫治疗策略已得到一定发展，但现有的常规dc体外诱导培养方法虽然可在一定程度上提升患者dc活性以及成熟度，但距离临床疗效所需的高度活化及成熟的dc刺激出机体显著的抗肿瘤免疫效应、达到显著的临床疗效仍有差距。由此，如何技术创新，研发dc活性和成熟度显著提升的体外dc培养技术，让mm患者免疫缺陷的dc活性及成熟度恢复正常或显著提高，为当前dc治疗策略中亟需解决的关键问题。


技术实现要素：

8.本发明的目的之一，就在于提供一种提高dc细胞活性的细胞培养基，以解决上述问题。
9.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种提高dc细胞活性的细胞培养基，包括rpmi 1640培养基，还包括益母草碱。
10.益母草碱(leonurine)是我国传统中药材益母草中所含的特异生物碱，为益母草中主要的有效单体成分，有望成为源于中国的少数几个成功的原创药物之一。益母草碱已被报道可通过甲基乙二醛(mgo)调节糖代谢从而展示出治疗糖尿病的可能潜力。同时，发明人课题组前期研究已证实，在小鼠及恒河猴的哺乳动物实验模型中，益母草碱显著地改善了血浆中脂质谱，明显地降低了血浆中胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白水平。亦已有研究报道益母草碱可调节脂代谢从而改善动脉粥样硬化。发明人课题组前期已研究报道益母草碱给药3周可显著地降低db/db小鼠模型中的空腹血糖水平以及升高血浆中的胰岛素水平，同时降低了血浆甘油三酯浓度以及升高了高密度脂蛋白浓度。
11.综上，益母草碱的作用机制与调控糖、脂代谢密切相关，但目前益母草碱对人dc的免疫调节作用及机制仍未见报道。
12.本技术研究显示益母草碱能显著提高体外培养、诱导形成dc细胞mhc分子(hla-dr)、共刺激分子(cd80\cd86\cd40)、成熟相关标志分子(cd83)的表达，显著提升dc的活性及成熟度。由此，发明人开创性地将益母草碱应用到体外培养诱导形成dc细胞的dc培养技术中，以获得高度活化及成熟的dc为具有良好潜力及转化应用前景的技术创新，而将益母草碱应用到dc培养技术中的dc培养技术方案，将于下述部分详细阐述。
13.作为优选的技术方案：所述益母草碱的浓度为0.9-1.1μm。发明人经过大量试验证实，益母草碱的浓度在1.1μm以上时，毒性很强，dc细胞活性不好不能达到很好效果；而益母草碱的浓度过低，对dc细胞活性提升不好，目标功效不好，达不到效果；益母草碱不同浓度下dc活性/成熟相关分子表达水平如图10所示。
14.根据发明人的试验证明：益母草碱的浓度为1μm时，为更优浓度。
15.作为进一步优选的技术方案：所述培养基还包括人血清、gm-csf、il-4、青霉素和链霉素。
16.作为更进一步优选的技术方案：所述组分的浓度为：5vol％人血清、800u/ml gm-csf、500u/ml il-4、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素。
17.本发明的目的之二，在于提供一种用于提高dc细胞活性的细胞培养方法，采用的技术方案为：在培养基中加入益母草碱。
18.作为优选的技术方案，包括下述步骤：
19.从外周血中分离出外周血单个核细胞，即pbmcs，将所述pbmcs在1640培养基中，于37℃、5vol％co2环境中培养24小时，然后洗去、弃去未黏附贴壁的细胞，得到dc前体细胞，然后将所述dc前体细胞于1640培养基、5vol％人血清、800u/ml gm-csf、500u/ml il-4、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和1μm益母草碱组成的培养基中，于37℃、5vol％co2培养7天，以诱导形成dc细胞，最后收获得到dc细胞。
20.与现有技术相比，本发明的优点在于：本方法发现在体外益母草碱在适当浓度下表现出显著的提升健康人及多发性骨髓瘤患者dc活性及成熟度的作用，显示出益母草碱作
为dc佐剂的潜力，可用于基于dc的治疗策略，例如dc疫苗和dc细胞疗法。
附图说明
21.图1为cd80
+
cd86
+
细胞(dcs)在总收获细胞中占比在hd组和mm患者组之间的比较；
22.图2为健康人益母草碱组和对照组之间cd80
+
cd86
+
细胞(dcs)在总收获细胞中占比的比较；
23.图3为健康人(n＝14)dcs上cd40表达的平均荧光强度(mfi)；
24.图4为健康人(n＝14)dcs上cd83表达的平均荧光强度(mfi)；
25.图5为健康人(n＝14)dcs上hla-dr表达的平均荧光强度(mfi)；
26.图6为mm患者益母草碱组和对照组之间cd80
+
cd86
+
细胞在总收获细胞中占比的比较；
27.图7为mm患者(n＝11)dcs上cd40表达的平均荧光强度(mfi)；
28.图8为mm患者(n＝11)dcs上cd83表达的平均荧光强度(mfi)；
29.图9为mm患者(n＝11)dcs上hla-dr表达的平均荧光强度(mfi)；
30.图10为益母草碱不同浓度下dc活性/成熟相关分子表达水平图。
具体实施方式
31.下面将结合附图对本发明作进一步说明。
32.实施例1：
33.一种用于提高dc细胞活性的细胞培养基，由下述组分组成：
34.rpmi1640培养基、5vol％人血清、800u/ml gm-csf、500u/ml il-4、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和1μm益母草碱。
35.实施例2
36.采用实施例1的培养基提高dc细胞活性的方法，包括下述步骤：
37.(1)获取人外周血单个核细胞：
38.抽取健康供者(healthy donor,hd；n＝14)或mm患者(n＝11)20ml外周静脉血(肝素抗凝)，以1
×
pbs 1：1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液液面上方，400
×
g、缓升速缓减速方式离心30min，其后提取、收集中间白色细胞层，即获得pbmcs。之后，用1
×
pbs洗涤pbmcs，其后400
×
g离心10min，弃去上清液；
39.(2)体外诱导形成dc：
40.将pbmcs重悬于含5vol％人血清、100u/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素的1640培养基中，均分为两组，以2
×
106个/ml的细胞浓度于37℃、5vol％co2环境中培养24小时，以使dc前体细胞(单核细胞)充分黏附、贴壁，之后洗去、弃去未黏附贴壁的细胞；将dc前体细胞于1640培养基、5vol％人血清、800u/ml gm-csf、500u/ml il-4、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和1μm益母草碱(或等量药物溶媒dmso)组成的培养基中，于37℃、5vol％co2培养7天，以培养、诱导形成dc细胞，其后收获dc细胞。
41.实施例3
42.dc细胞成熟度及活性的评估
43.本实施例选择了dc细胞mhc分子hla-dr(激活t细胞第一信号必需)、共刺激分子
cd86、cd80以及cd40(激活t细胞第二信号必需)、成熟相关标志分子(cd83)这五个分子作为dc成熟度的标志物；
44.洗涤实施例2收集的细胞，重悬于预冷的1
×
pbs中，然后加入apc标记的cd40单克隆抗体(mab)，apc-a750标记的cd83 mab，pe标记的cd86 mab，fitc标记的cd80 mab和pacific blue标记的hla-dr mab或相同浓度同型匹配的阴性对照mab，在4℃孵育30分钟；随后，将细胞洗涤两次并重悬于预冷的1
×
pbs中，以通过流式细胞术进行免疫荧光分析。在facs分析系统中，圈出总细胞中cd80
+
cd86
+
细胞群作为dcs，分别分析dcs上cd40、cd83和hla-dr表达的平均荧光强度(mfi)；
45.使用graphpad prism 5.0软件进行统计分析。配对t检验比较益母草碱组与对照组cd40、cd83和hla-dr的表达,独立样本t检验用于比较益母草碱组和对照组之间cd80
+
cd86
+
细胞群体的比例，p＜0.05被认为具有统计学意义，结果如下：
46.1)hd-dc与mm-dc的比较(未予益母草碱处理)
47.本实施例比较了hd组和mm患者组之间cd80
+
cd86
+
细胞在总收获细胞中占比的差异，发现hd组收获的细胞中cd80
+
cd86
+
细胞占比显著高于mm患者组(75.55％
±
9.69％vs 61.39％
±
4.86％，p＝0.000)，如图1所示。
48.2)益母草碱对健康人dc细胞的作用
49.本实施例分析整体14例健康人益母草碱组和对照组dc细胞的差异，发现cd80
+
cd86
+
细胞在总收获细胞中的占比在益母草碱组和对照组之间无统计学差异(75.45％
±
8.79％vs 75.55％
±
9.69％，p＝0.933)，如图2所示；
50.但是dcs上cd40表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(2.11
×
105±
0.92
×
105vs 1.81
×
105±
0.72
×
105，p＝0.049)(表1，图3)；dcs上cd83表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(2.41
×
105±
2.06
×
105vs 2.14
×
105±
1.71
×
105，p＝0.042)(表2，图4)；dcs上hla-dr表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(12.21
×
105±
4.20
×
105vs11.11
×
105±
3.94
×
105，p＝0.013)(表3，图5)。
51.表1.健康人(n＝14)dcs上cd40表达的平均荧光强度(mfi)(105)
[0052][0053]
图3可以看出：dcs上cd40表达的平均荧光强度在益母草碱组和对照组之间的比较(hd，n＝14)。图3a显示了每例hd益母草碱组和对照组dcs上cd40表达的平均荧光强度；图3b显示，dcs上cd40表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(2.11
×
105±
0.92
×
105vs 1.81
×
105±
0.72
×
105，p＝0.049)。
[0054]
表2.健康人(n＝14)dcs上cd83表达的平均荧光强度(mfi)(105)
[0055][0056]
图4可以看出：dcs上cd83表达的平均荧光强度在益母草碱组和对照组之间的比较(hd，n＝14)。图4a显示了每例hd益母草碱组和对照组dcs上cd83表达的平均荧光强度；图4b
显示，dcs上cd83表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(2.41
×
105±
2.06
×
105vs 2.14
×
105±
1.71
×
105，p＝0.042)。
[0057]
表3.健康人(n＝14)dcs上hla-dr表达的平均荧光强度(mfi)(105)
[0058][0059]
图5可以看出:dcs上hla-dr表达的平均荧光强度在益母草碱组和对照组之间的比较(hd，n＝14)。图5a显示了每例hd益母草碱组和对照组dcs上hla-dr表达的平均荧光强度；图5b显示，dcs上hla-dr表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(12.21
×
105±
4.20
×
105vs 11.11
×
105±
3.94
×
105，p＝0.013)。
[0060]
3)益母草碱对mm患者dc细胞的作用
[0061]
本实施例分析整体11例mm患者益母草碱组和对照组dc细胞的差异，发现cd80
+
cd86
+
细胞在总收获细胞中的占比在益母草碱组显著高于对照组(64.86％
±
5.41％vs 61.39％
±
4.86％，p＝0.029)(图6)。dcs上cd40表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(1.99
×
105±
0.98
×
105vs 1.72
×
105±
0.78
×
105，p＝0.025)(表4，图7)；dcs上cd83表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(0.30
×
105±
0.18
×
105vs 0.27
×
105±
0.16
×
105，p＝0.020)(表5，图8)；dcs上hla-dr表达的平均荧光强度在益母草碱组亦显著高于对照组(7.49
×
105±
2.58
×
105vs 6.80
×
105±
2.18
×
105，p＝0.006)(表6，图9)。
[0062]
表4.mm患者(n＝11)dcs上cd40表达的平均荧光强度(mfi)(105)
[0063][0064]
图7可以看出：dcs上cd40表达的平均荧光强度在益母草碱组和对照组之间的比较(mm，n＝11)。图7a显示了每例mm患者益母草碱组和对照组dcs上cd40表达的平均荧光强度；图7b显示，dcs上cd40表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(1.99
×
105±
0.98
×
105vs 1.72
×
105±
0.78
×
105，p＝0.025)。
[0065]
表5.mm患者(n＝11)dcs上cd83表达的平均荧光强度(mfi)(105)
[0066][0067]
图8可以看出：dcs上cd83表达的平均荧光强度在益母草碱组和对照组之间的比较(mm，n＝11)；图8a显示了每例mm患者益母草碱组和对照组dcs上cd83表达的平均荧光强度；图8b显示，dcs上cd83表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(0.30
×
105±
0.18
×
105vs 0.27
×
105±
0.16
×
105，p＝0.020)。
[0068]
表6.mm患者(n＝11)dcs上hla-dr表达的平均荧光强度(mfi)(105)
[0069][0070]
图9可以看出：dcs上hla-dr表达的平均荧光强度在益母草碱组和对照组之间的比较(mm，n＝11)；图9a显示了每例mm患者益母草碱组和对照组dcs上hla-dr表达的平均荧光强度；图9b显示，dcs上hla-dr表达的平均荧光强度在益母草碱组显著高于对照组(7.49
×
105±
2.58
×
105vs 6.80
×
105±
2.18
×
105，p＝0.006)。
[0071]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。