产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物工程，具体涉及产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、琥珀酸，学名丁二酸，是三羧酸循环过程中的一种四碳二元酸，主要被用作表面活性剂、离子螯合剂、食品添加剂，也用于生产聚氨酯、聚丁二酸丁二醇酯等生物可降解材料，广泛应用于医药、食品、化工、农业等行业，具有广阔的市场需求。2004年美国能源部发布报告将琥珀酸列为12种最有潜力大宗生物基化学品中的首位。

2、目前工业化生产丁二酸的技术主要有：催化加氢法、电解法和生物发酵法。催化加氢法和电解法均是以顺酐为原料的化学合成法，由于石油资源的减少和环境污染日益严重等问题，化学合成方法的弊端日益显现。与化学合成法相比，生物发酵法具有原料来源广、价格便宜、可再生、反应条件温和、低碳环保等优点，因此具有良好的发展前景。

3、目前琥珀酸发酵菌种分为两大类，第一类是天然产琥珀酸菌株，如放线杆菌、厌氧螺菌、曼海姆菌，第二类是通过代谢过程改造的工程菌，主要是大肠杆菌和酵母菌。天然产丁二酸菌株虽然能高产琥珀酸但有明显的缺点，如不耐酸、不耐氧，只利用葡萄糖为碳源，高昂的培养成本，限制了其大规模工业化生产。大肠杆菌工程菌发酵生产效率较低、不耐酸、发酵过程中有乳酸、甲酸、乙酸、乙醇等副产物产生，同时发酵过程辅因子代谢不平衡、不能耐受高浓度的产物浓度以及底物葡萄糖浓度、高浓度渗透压和葡萄糖吸收利用速度过快等导致代谢失衡的问题。目前解脂酵母工程菌分批补料发酵高产琥珀酸可达110g/l，但解脂酵母是严格好氧型菌，并且利用昂贵的甘油为原料，生产成本高。酿酒酵母作为真核模式微生物，具有遗传背景清晰、易操作、耐低ph、耐受高浓度底物、营养需求简单、成本低廉、兼性厌氧等特性。目前酿酒酵母通过基因工程改造，好氧条件下分批补料发酵产量能达到43g/l，由此可见酿酒酵母是发酵生产琥珀酸的潜在最适微生物。

4、然而，利用酿酒酵母基因工程菌发酵生产琥珀酸面临一些问题，包括：草酰乙酸会被丙酮酸羧化酶基因pyc2催化合成，但在厌氧发酵时又会被pck催化降解，以释放atp促进菌体生长，所以草酰乙酸需要严格调控，使其既能满足进入tca循环时琥珀酸累积，又能在厌氧发酵时提供atp利于菌生长。因此，需要结合分子遗传技术和传统微生物选育手段，改造起始酿酒酵母菌株，开发一种可厌氧发酵高产琥珀酸并降低副产物积累的酿酒酵母工程菌。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明以酿酒酵母为出发菌株，通过敲除产生副产物乙醇、甘油、乙酸的基因、增强草酰乙酸供应、强化琥珀酸还原途径代谢流以及加快琥珀酸的外排和分泌，获得一株可厌氧发酵产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌；对该酿酒酵母基因工程菌进一步驯化筛选，获得可厌氧发酵高产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌，具有重要的工业应用价值。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，对酿酒酵母菌株进行下述(1)-(8)中的一种或几种组合改造：

4、(1)敲除乙醇脱氢酶基因adh1；

5、(2)敲除3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1；

6、(3)敲除乙酰辅酶a水解酶基因ach1；

7、(4)敲除琥珀酸脱氢酶基因sdh5；

8、(5)过表达丙酮酸羧化酶基因pyc2；

9、(6)过表达富马酸还原酶基因frd；

10、(7)过表达酿酒酵母线粒体柠檬酸转运载体yhm2；

11、(8)过表达栗酒裂殖酵母苹果酸转运蛋白spmae1。

12、在本发明的一种实施方式中，对酿酒酵母菌株进行下述(1)-(4)的改造，通过敲除乙醇脱氢酶基因adh1，在高浓度糖发酵下降低乙醇的产生，敲除3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1，以减少副产物甘油的产生，敲除乙酰辅酶a水解酶基因ach1，以消除乙酸积累导致细胞生长较慢的影响，减少碳流的流失，敲除琥珀酸脱氢酶基因sdh5，以阻断琥珀酸氧化途径的下游代谢。

13、在本发明的一种实施方式中，对酿酒酵母菌株进行下述(1)-(6)的改造，通过敲除乙醇脱氢酶基因adh1，在高浓度糖发酵下降低乙醇的产生，敲除3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1，以减少副产物甘油的产生，敲除乙酰辅酶a水解酶基因ach1，以消除乙酸积累导致细胞生长较慢的影响，减少碳流的流失，敲除琥珀酸脱氢酶基因sdh5，以阻断琥珀酸氧化途径的下游代谢，过表达丙酮酸羧化酶基因pyc2，提高上游草酰乙酸的供应，过表达来自布鲁氏锥虫的富马酸还原酶frd基因，来强化琥珀酸还原途径代谢流。

14、在本发明的一种实施方式中，对酿酒酵母菌株进行下述(1)-(8)的改造，通过敲除乙醇脱氢酶基因adh1，在高浓度糖发酵下降低乙醇的产生，敲除3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1，以减少副产物甘油的产生，敲除乙酰辅酶a水解酶基因ach1，以消除乙酸积累导致细胞生长较慢的影响，减少碳流的流失，敲除琥珀酸脱氢酶基因sdh5，以阻断琥珀酸氧化途径的下游代谢，过表达丙酮酸羧化酶基因pyc2，提高上游草酰乙酸的供应，过表达来自布鲁氏锥虫的富马酸还原酶frd基因，来强化琥珀酸还原途径代谢流，过表达酿酒酵母线粒体柠檬酸转运载体yhm2和栗酒裂殖酵母苹果酸转运蛋白spmae1，有利于琥珀酸的外排和分泌。

15、在本发明的一种实施方式中，所述乙醇脱氢酶基因adh1的核苷酸序列的基因登录号为gene id:854068(seq id no：1所示)；所述3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1的核苷酸序列的基因登录号为gene id:851539(seq id no：2所示)；所述乙酰辅酶a水解酶基因ach1的核苷酸序列的基因登录号为gene id:852266(seq id no：3所示)；所述琥珀酸脱氢酶基因sdh5的核苷酸序列的基因登录号为gene id:854083(seq id no：4所示)；所述丙酮酸羧化酶基因pyc2来源于酿酒酵母，核苷酸序列的基因登录号为gene id:852519(氨基酸序列为seq id no：5所示)；所述富马酸还原酶基因frd来源于布鲁氏锥虫，根据登录号为genbank:alm30213.1(氨基酸序列为seq id no：6所示)的frd氨基酸序列将密码子优化为酿酒酵母偏好性而获得；所述线粒体柠檬酸转运载体yhm2来源于酿酒酵母，核苷酸序列的基因登录号为gene id:855282(氨基酸序列为seq id no：7所示)；所述苹果酸转运蛋白spmae1来源于栗酒裂殖酵母，核苷酸序列的基因登录号为gene id:254334(氨基酸序列为seq id no：8所示)。

16、第二方面，本发明提供了利用上述构建方法制备得到的产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌。

17、在本发明的一种实施方式中，通过对酿酒酵母菌株by4741进行上述(1)-(4)的改造得到，记为酿酒酵母基因工程菌hm1。

18、在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母菌株为对酿酒酵母by4741，其基因型为mata his3δ1leu2 met15δura3-52。

19、在本发明的一种实施方式中，所述乙醇脱氢酶基因adh1、3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd1、乙酰辅酶a水解酶基因ach1以及琥珀酸脱氢酶基因sdh5敲除元件的上下同源臂是以酿酒酵母by4741基因组为模板，筛选标记以pyes2质粒为模板，进行pcr扩增得到。

20、在本发明的一种实施方式中，通过对酿酒酵母菌株by4741进行上述(1)-(8)的改造得到，记为酿酒酵母基因工程菌hm2。

21、在本发明的一种实施方式中，所述过表达丙酮酸羧化酶基因pyc2是向酿酒酵母基因工程菌hm1导入含pyc2的质粒pesc-his-pyc2。

22、在本发明的一种实施方式中，所述导入丙酮酸羧化酶基因pyc2的方法包括如下步骤：组成型启动子pgk1融合pyc2，pesc-his质粒通过双酶切线性化，线性化质粒与融合的序列通过一步克隆化转至dh5α，挑取转化子进行pcr验证，测序正确的转化子接菌培养，提取质粒即为pesc-his-pyc2，向所述酿酒酵母基因工程菌hm1导入质粒。

23、在本发明的一种实施方式中，所述过表达富马酸还原酶基因frd是向酿酒酵母基因工程菌hm1中导入含富马酸还原酶基因frd的质粒，所述质粒为pesc-his-pyc2-frd。

24、在本发明的一种实施方式中，所述导入富马酸还原酶基因frd的方法包括如下步骤：根据布鲁氏锥虫的frd氨基酸序列(登录号为genbank:alm30213.1)进行密码子优化，优化为酿酒酵母密码子偏好性，并常规合成基因tdh3-frd-tpi1，添加5'(xmai)和3'(sali)，将基因通过5'(xmai)和3'(sali)克隆至载体pesc-his-pyc2质粒，制备mini-scale重组质粒dna和含有该重组质粒的穿刺菌，提取质粒，即为tdh3强启动子下表达frd的pesc-his-pyc2-frd。

25、在本发明的一种实施方式中，所述过表达酿酒酵母线粒体柠檬酸转运载体yhm2和栗酒裂殖酵母苹果酸转运蛋白spmae1，是向酿酒酵母基因工程菌hm1导入含yhm2和spmae1基因的质粒，所述质粒为pesc-his-pyc2-frd-yhm2-spmae1；

26、在本发明的一种实施方式中，所述导入yhm2和spmae1基因的方法包括如下步骤：构建fba1启动子下表达yhm2，eno1启动子下表达spmae1的pesc-his-pyc2-frd-yhm2-spmae1质粒，向所述酿酒酵母基因工程菌hm1中导入该质粒，构建的菌记作酿酒酵母基因工程菌hm2。

27、第三方面，本发明提供了一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌hm3，所述酿酒酵母基因工程菌hm3于2022年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20221705，分类命名为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。

28、第四方面，本发明提供了上述产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌或酿酒酵母基因工程菌hm1或酿酒酵母基因工程菌hm2或酿酒酵母基因工程菌hm3在生产琥珀酸中的应用。

29、在本发明的一种实施方式中，所述生产琥珀酸的方法包括：在发酵培养基上发酵培养上述产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌或酿酒酵母基因工程菌hm1或酿酒酵母基因工程菌hm2或酿酒酵母基因工程菌hm3。

30、在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的方法为：将上述产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌或酿酒酵母基因工程菌hm1或酿酒酵母基因工程菌hm2或酿酒酵母基因工程菌hm3的种子液以3-6％的接种量接种至发酵培养基中，于28-32℃、180-240rpm条件下发酵培养65-80h，发酵过程控制ph为6.0-7.0。

31、在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养方法包括下述步骤：将30℃，220rpm下培养20h的酿酒酵母基因工程菌种子液5％接种量转入发酵培养基，于30℃，220rpm条件下培养。

32、在本发明的一种实施方式中，每24小时，将发酵液转接到新的发酵培养基中，使初始od600达0.1。

33、在本发明的一种实施方式中，发酵过程使用5m nahco3控制ph在7.0。

34、在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：葡萄糖50g/l，ynb6.7g/l，dosupplement-his 1.29g/l，磷酸二氢钾10g/l，硫酸镁5g/l，nahco3 8.4g/l，微量元素储存液8ml/l，维生素储存液8ml/l；

35、所述微量元素储存液成分为：edta 15g·l-1、znso4·7h2o 4.5g·l-1、mncl2·2h2o0.84g·l-1、cocl2·6h2o 0.30g·l-1、cuso4·5h2o 0.30g·l-1、na2moo4·2h2o 0.40g·l-1、cacl2·2h2o 4.50g·l-1、feso4·7h2o 3.00g·l-1、h3bo3 1.00g·l-1、ki 0.10g·l-1。

36、所述维生素储存液成分为：生物素(d-)(c10h16n2o3s)0.05g·l-1、泛酸钙d(+)(c18h32can2o10)1.00g·l-1、烟酸(c6h5no2)1.00g·l-1、肌醇(c6h12o6)25.00g·l-1、氯化硫胺盐酸盐(c12h18cl2n4os×h2o)1.0g·l-1、盐酸吡哆醇(c8h12clno3)1.00g·l-1、对氨基苯甲酸(c7h7no2)0.20g·l-1。

37、在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：葡萄糖20g/l，酵母浸粉10g/l，蛋白胨20g/l。

38、在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母基因工程菌种子液由新鲜的酿酒酵母基因工程菌单菌落接种到含有10ml种子培养基中，30℃，220rpm振荡培养18h得到。

39、在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为ypd：葡萄糖20g/l，酵母浸粉10g/l，蛋白胨20g/l，溶剂为水。

40、在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为sd-his：葡萄糖20g/l，ynb6.7g/l，do supplement-his 1.29g/l。

41、与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：本发明以酿酒酵母为出发菌，通过敲除一系列副产物代谢途径基因、过表达强化琥珀酸代谢流的相关基因及利于琥珀酸外排和分泌的转运蛋白。并进一步通过代谢进化技术首次获得能够在厌氧条件下发酵生产丁二酸的具有工业实用性能的酿酒酵母菌株，其可在厌氧条件下积累琥珀酸达到21g/l，具有较高的转化率，有效减少了碳流的流失，且副产物产量极低，本发明具有极高的工业应用价值。