抗猪红细胞膜抗体的制备及应用的制作方法

1.本发明涉及体外诊断领域，具体涉及抗猪红细胞膜抗体的制备及应用。


背景技术：

2.猪相关疾病诊断、用药后监测、及生猪国际贸易检疫等大都选用快速检测技术。现阶段较为流行的快速检测方法为胶体金快速检测方法，例如非洲猪瘟胶(asfv)胶体金检测法、猪繁殖与呼吸综合征(prrs)相关胶体检测法、猪肺炎支原体(mhp)胶体金检测法等。血清或血浆样本因制备时间过长，胶体金检测技术一般选用全血作为检测样本。全血直接应用在胶体金试纸条上前，通常需要使用滤血膜过滤除去血红细胞。但此样本前处理存在许多不足之处，例如全血样本需求量大，滤膜价格较为昂贵，分离速度较慢，且易出现红细胞过滤不完全或者溶血现象，检测时红细胞及红细胞释放的血红蛋白会因层析作用到达检测区，使检测窗口的背景颜色增加，进而对检测线的定性、半定量及定量检测产生干扰。
3.专利cn206740777u通过增加抗人rbc抗体拦截线的方式拦截多余的红细胞，拦截线的加入，使得跑膜更好，背景更干净。目前已经证明多种哺乳动物、啮齿类动物、禽类红细胞具有免疫粘附功能，目前已经证实cr1是动物红细胞免疫粘附受体，对于不同检测背景下的血红细胞黏附来说，目前的黏附受体种类过于单一，因此，开发新的更具针对性的血细胞黏附受体具有重大的现实意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗猪红细胞膜抗体的制备及应用。
5.本发明提供了抗猪红细胞膜的单克隆抗体，其是以猪红细胞免疫balb/c小鼠后通过杂交瘤技术筛选得到的特异性强的猪红细胞膜抗体，经抗体亚型鉴定为igg1型，免疫小鼠血样抗体效价为1:128k。
6.对以抗体基因恒定区序列设计的引物扩增的产物进行鉴定，结果表明，本发明所述的抗猪红细胞膜的单克隆抗体，其具有如seq id no：1所示的重链可变区和如seq id no：2所示的轻链可变区，与目前市售血细胞抗体均不相同，并且其具有较强的特异性。
7.更进一步的，本发明所述的单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为鼠igg型；所述轻链恒定区为鼠igg型。
8.本发明所述的单克隆抗体比其他市售抗体性能更优秀，实验结果表明，本发明所述的单克隆抗体用于血细胞黏附时，在极低的浓度便可获得较好的血细胞黏附效果。在本发明的一些具体的实施例中，将所述的单克隆抗体以15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml的浓度包被于检测试纸条中用于血细胞黏附效果的观察，结果表明15μg/ml即可具有良好的血细胞黏附效果，相较于市售的其他血细胞抗体具有更好的血细胞黏附效果。
9.本发明提供了编码所述单克隆抗体的核酸。
10.进一步的，本发明中，
11.编码所述单克隆抗体重链可变区的核酸如seq id no：7所示；
12.编码所述单克隆抗体轻链可变区的核酸如seq id no：8所示。
13.本发明中，所述的核酸可以是dna、rna、cdna或pna。在本发明实施例中，所述核酸为dna形式。所述dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。所述dna可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述rna形式为由基因转录获得的mrna等。
14.本发明提供了表达模块，其包括启动子、终止子和本发明所述的核酸。
15.进一步的，所述的表达模块包括本发明所述的核酸以单个或多个串联形式与所述启动子、终止子组成的表达模块，本发明对此不做限定。
16.本发明中还提供了含有所述的核酸或所述的表达模块的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的dna序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(a)信号等。
17.本发明提供了重组载体，其包括：
18.载体骨架和本发明所述的核酸；
19.或载体骨架和本发明所述的表达模块。
20.进一步的，本发明还提供了含有所述重组载体的脂质体纳米颗粒；所述的脂质纳米颗粒包括但不限于聚合物脂质杂化纳米粒或固体脂质纳米颗粒。
21.本发明所述的重组载体，是指核酸载体，是一种重组dna分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对细菌中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知细菌细胞利用启动子，增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。
22.本发明提供了宿主，其包括如下i)～iii)所示中的至少一种：
23.i)、分泌如本发明所述的单克隆抗体；
24.ii)、基因组整合如本发明所述的核酸或本发明所述的表达模块；
25.iii)、转染或转化如本发明所述的重组载体。
26.本发明中，重组载体转染或转化进入宿主；所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。在一些具体的实施例中，本发明通过电转化方式进行所述宿主的构建。
27.进一步的，本发明所述的宿主包括细菌、真菌、病毒或动物。所述细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌；所述革兰氏阳性菌包括但不限于大肠杆菌。所述真菌包括霉
菌、酵母、蕈菌；所述酵母包括啤酒酵母、酿酒酵母、毕赤酵母和假丝酵母等。所述病毒包括但不限于包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、阮病毒。所述动物包括人、鼠、兔、猪斑马鱼等。
28.本发明提供了所述的单克隆抗体的制备方法，其为培养本发明所述的宿主，获得所述单克隆抗体。
29.本发明提供了黏附血细胞的产品，其原料包括如下a)～c)所示中的至少一种：
30.a)、本发明所述的单克隆抗体；
31.b)、本发明所述的核酸；
32.c)、本发明所述的表达模块；
33.d)、本发明所述的重组载体；
34.e)、本发明所述的宿主；
35.f)、本发明所述的制备方法制得的含有所述单克隆抗体的培养物。
36.进一步的，本发明所述的产品还包括溶剂和/或辅料，所述溶剂和/或辅料应用于所述产品中，用于维持所述原料的稳定性或帮助所述原料发挥作用。
37.进一步的，所述溶剂包括但不限于tb缓冲液、pbs缓冲液、tris缓冲液、kcl缓冲液或nacl缓冲液。所述辅料包括但不限于蛋白、载体、抗氧化剂、表面活性剂和/或蛋白酶抑制剂；所述蛋白包括但不限于bsa；所述载体包括但不限于用于病毒包装的辅助载体、用于噬菌体包装的辅助载体，和/或用于真核或原核宿主细胞基因组整合的辅助载体，本发明对此不做限定；所述抗氧化剂包括但不限于dtt或β-巯基乙醇。所述的表面活性剂包括但不限于triton-x-100。所述的蛋白酶抑制剂包括但不限于pmsf。
38.在一些具体的实施例中，本发明所述的缓冲液为tb缓冲液，所述tb缓冲液的ph为7.6。
39.进一步的，本发明所述的产品包括试纸条，其上包被有本发明所述的单克隆抗体。在一些具体实施例中，本发明所述的试纸条为胶体金试纸条，其包括背衬卡，在背衬卡上端依次固定有样本垫、胶体金垫、nc膜和吸水板；胶体金垫上设有金标记本发明所述的单克隆抗体。实验结果表明，本发明所述的单克隆抗体包被浓度在15μg/ml时其拦截猪全血的效果已达到常规离心处理法水平，效果优于市面上其他猪全血抗体。
40.本发明所述的产品还包括血细胞黏附剂，用于血清样本中血细胞的黏附。所述的血细胞黏附剂还包括偶联介质和/或缓冲液；所述偶联介质包括但不限于聚苯乙烯平板、磁珠或胶体金，所述偶联介质与本发明所述的单克隆抗体偶联制成血细胞黏附剂用于血清样本的处理。
41.本发明所述的产品还包括试剂盒，其利用本发明所述的单克隆抗体对血清进行处理。
42.进一步的，所述的试剂盒还包括缓冲液、洗涤液、封闭液和/或显色液，本发明对此不做限定。
43.本发明提供了所述的产品在血清样本处理中的应用。
44.血清样本的处理方法，其包括以本发明所述的抗体吸附血液中的红细胞，获得血清。
45.本发明取得的有益效果：
46.本发明使用猪红细胞作为免疫原，制备得到了一种可识别猪红细胞的单克隆抗体
3b6，该抗体的效价为1:128k，15μg/ml即可具有良好的血细胞黏附效果，说明其对血红细胞具有较高的粘附性；本发明所获得的3b6鼠单克隆抗体可用在猪全血检测胶体金的快速检测上，该技术可省略了猪血浆/血清分离的步骤，节省了检测成本、时间，具有较高的应用价值。
附图说明
47.图1为杂交瘤细胞株筛选过程中的细胞上清检测结果；
48.图2为抗猪红细胞膜鼠单克隆抗体的血凝试验(ha)鉴定结果；
49.图3为本发明制备的胶体金试纸条示意图；
50.图4为本发明制备的3b6抗体在猪全血胶体金试纸条技术上的应用；
51.图5为本发明制备的抗红细胞单克隆抗体拦截猪全血效果与常规处理方法比对(a图为样本1结果，b图为样本2结果)。
具体实施方式
52.本发明提供了抗猪红细胞膜抗体的制备及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
53.单克隆抗体3b6重链可变区的氨基酸序列为：evqlqqsgpelvkpgtsvkisckasgysftghfmnwvmqshgkslewigrinpyigdtfynqkfkgkatltvdkssstahmelrslasedsavyycarssgsdyisyyyamdywgqgtsvtvss(如seq id no：1所示)。
54.单克隆抗体3b6轻链可变区的氨基酸序列为：nilmtqspsslsaslgervsltcrtsqeisgylswlqqkpdgtikrliyaastldsgvpkrfsgsrsgsdysltisslesedfadyyclqytsypftfgsgtkleik(如seq id no：2所示)。
55.4c-lf自5
′
端到3
′
的核酸序列为:gacattgtgatgacccagtctcct(seq id no:3)。
56.4c-lr自5
′
端到3
′
的核酸序列为:tggacactgttggggccgcatcggccct(seq id no:4)。
57.4c-hf自5
′
端到3
′
的核酸序列为:caggtgcagctgcaggagtcagga(seq id no:5)。
58.4c-hr自5
′
端到3
′
的核酸序列为：gatagacagatgggggtgtcgttttggc(seq id no:6)。
59.编码单克隆抗体3b6重链可变区的核酸为：gaggtccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggccactttatgaactgggtgatgcagagccatggaaagagccttgagtggattggacgtattaatccttacattggtgatactttctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaaatcctctagcacagcccacatggagctccggagcctggcatctgaggactctgcagtctattattgtgcaagatcttccggtagtgactacatatcctattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(如seq id no：7所示)。
60.编码单克隆抗体3b6轻链可变区的核酸为：aacattctgatgacccagtctccatcctccttatctgcctctctgggagaaagagtcagtctcacttgtcggacaagtcaggaaattagtggttacttaagctggctt
cagcagaaaccagatggaactattaaacgcctgatctacgccgcatccactttagattctggtgtcccaaaaaggttcagtggcagtaggtctgggtcagattattctctcaccatcagcagccttgagtctgaagattttgcagactattactgtctacaatatactagttatccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa(如seq id no：8所示)。
61.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
62.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
63.实施例1猪红细胞制备
64.采集20ml新鲜猪血置于无菌离心管中(含抗凝剂)，4℃，4000r/min条件下离心10min，弃上清，沉淀用20ml 0.02m pbs溶液复溶，复溶后重复上述操作直至上清无明显红色，最后一次弃上清，即得红细胞，最终用0.02m pbs溶液重悬成2％的红细胞悬液，4℃保存备用。
65.实施例2抗猪红细胞膜鼠单克隆抗体制备
66.1.小鼠免疫
67.将2％猪红细胞腹腔免疫5周龄的雌性balb/c小鼠，初免剂量为每只小鼠2％的猪红细胞体积为0.5ml，第一次免疫后间隔21天、42天分别进行第二次和第三次免疫，免疫剂量为每只小鼠2％的猪红细胞体积0.5ml，免疫方式均为腹腔注射，第三次免疫后7～10天左右尾部采血，采用血凝法(ha)测血清效价。
68.2.杂交瘤细胞制备
69.融合：选择血凝试验检测血清效价大于104的小鼠进行脾内加强免疫，免疫剂量为0.5ml 2％猪红细胞，免疫方式为腹腔注射。加强免疫三天后取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞ns1按照8:1比例进行peg融合，融合的细胞在含hat的dmem培养基(gibco)上进行培养，每孔200μl细胞悬液置于96孔细胞培养板中培养。前三天内不要移动96孔细胞培养板，第三、四天每孔补加一滴的hat的dmem培养基(gibco)。
70.融合后6～7天左右，用血凝试验检测细胞培养上清中的特异性抗体含量，发生凝集的细胞株共有10株，选择凝集反应最强的10#细胞孔用有限稀释法进行3轮亚克隆(见图1)，亚克隆阶段选择ht的dmem培养基(gibco)，最终得到一株能稳定分泌抗猪红细胞膜的杂交瘤细胞株，命名为3b6。
71.3.抗猪红细胞膜抗体的制备、纯化。
72.将3b6杂交瘤细胞株注射到预先经液体石蜡处理过的小鼠腹腔内，7～10天后收集小鼠腹水，选择辛酸-硫酸铵法进行粗纯，后又选用亲和层析法(spa)进行精纯得到抗猪红细胞膜抗体，采用超微量分光光度计a280法测得该抗体浓度为5mg/ml。
73.4.抗猪红细胞膜单克隆抗体的鉴定
74.4.1抗体亚型鉴定
75.采用直接elisa法测定3b6鼠单克隆抗体的亚型，将该株抗体用cb缓冲液配成2μg/ml的工作液，每孔50μl包被酶免板后于4℃孵育12～16h，然后甩出孔内液体，用pbst洗涤3次后，每孔加入150μl的1％casein封闭液，在37℃条件下孵育2h，甩出孔内液体，拍干，将包好的酶免板烘干后备用。在酶免板内，按列分别加入不同的亚型酶(sigma)，37℃孵育30min，pbst洗涤6次后，加底物、显色液于室温显色15min，加入终止液终止反应，最后于酶标仪450nm处读数。结果见下表1。
76.表1.3b6鼠单克隆抗体亚型鉴定
77.亚型试剂3b6igg12.494igg2a0.067igg2b0.054igg30.053igm0.068iga0.066空白0.049
78.由表1可见，空白对照的od值为0.049，igg1亚型试剂的od值为2.494，其余亚型试剂od值均与空白对照相当，由此可知该抗体的亚型为igg1型。
79.4.2抗体效价检测
80.采用直接凝集试验检测3b6鼠单克隆抗体的效价。按照实施例1中的方法制备红细胞，然后用0.02m pbs分别将分离的红细胞配制成1％的红细胞悬液，3b6鼠单抗稀释1000倍备用。准备96孔v型血凝板，1～12孔依次加入25μl 0.02mpbs，然后在第1孔内加入25μl稀释1000倍的3b6鼠单抗，混匀后，从第1孔中吸取25μl的液体加入到第2孔中，依次类推，倍比稀释至第11孔后，舍去25μl的液体，第12孔为阴性对照；然后1～12孔每孔再加入25μl 1％的红细胞悬液，摇匀后，置于室温静置15min观察结果，以能使100％红细胞凝集的抗体最高稀释倍数作为该抗体的效价。结果如图2所示。由图2可知，该抗体的效价为1:128k。
81.5.单克隆抗体测序
82.根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物：
83.4c-lf 5
′‑
gacattgtgatgacccagtctcct-3
′
(seq id no：3)；
84.4c-lr 5
′‑
tggacactgttggggccgcatcggccct-3
′
(seq id no：4)；
85.4c-hf 5
′‑
caggtgcagctgcaggagtcagga-3
′
(seq id no：5)；
86.4c-hr 5
′‑
gatagacagatgggggtgtcgttttggc-3
′
(seq id no：6)。
87.用trizol reagent试剂提取3
×
106杂交瘤细胞3b6的总rna，将总rna逆转录成cdna。用4c-hf和4c-hr为引物进行pcr扩增单克隆抗体4c10、6f9重链可变区，用4c-lf和4c-lr为引物进行pcr扩增单克隆抗体抗4c10、6f9轻链可变区，pcr反应均采用热启动，反应条件：95℃5分钟；95℃15秒，55℃45秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段。克隆到pm18-t载体中，转化大肠杆菌dh5α细胞后在lb固体平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨苄的lb液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用qiagen的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了单克隆抗体3b6的重链和轻链可变区序列。
88.单克隆抗体3b6重链可变区具有seq id no：1所示氨基酸序列，轻链可变区具有seq id no：2所示氨基酸序列。
89.实施例3抗猪红细胞膜抗体在检测猪全血胶体金试纸条上的应用1.一种猪全血直接检测胶体金试纸条制备方法
90.该试纸条包括背衬卡，背衬卡为粘性设置，在背衬卡上端依次固定有样本垫、胶体金垫、nc膜和吸水板；其中，样本垫一端与金垫一端相互重合，样本垫一端位于上侧，重合长
度为2～3mm，胶体金垫上设有金标记特异性抗体；nc膜两端分别与胶体金垫、吸水板一端相互重合，且nc膜两端位于下侧，重合长度为2～3mm，该nc膜在靠近金标垫的一侧设有检测线，在靠近吸水板的一侧设有质控线，此外，样本垫上包被有抗猪红细胞抗体，如图3所示。
91.2.样本垫上包被红细胞抗体
92.将抗猪红细胞鼠单克隆抗体3b6用ph＝7.6、0.01m的tb包被缓冲液稀释成15μg/ml，tb包被缓冲液中含有1％的bsa封闭蛋白、0.01％的triton-x-100表面活性剂。将包被缓冲液稀释后的抗体喷在硝酸纤维素膜上，在37.0℃
±
2.0℃的干燥箱内干燥10小时后，按照胶体金试纸条的结构组配成层析纸条，层析纸条使用铝箔袋密封后室温保存备用。收集添加抗凝剂的猪全血样本，分别取60μl滴入制备好的层析试纸条样本垫上，同时设置不含抗猪红细胞膜鼠单克隆抗体的样本垫作为对照，室温水平放置15分钟，观察样本层析情况。
93.结果见图4，1#层析纸条为含抗红细胞抗体的样本垫，可以看到红细胞被全部吸附在样本垫上，且背景干净，层析效果较好；2#层析纸条为不含抗红细胞抗体的样本垫，可以看到检测区的nc膜上面背景颜色较深，对检测结果产生干扰。综上所述，本发明所获得的3b6鼠单克隆抗体可用在猪全血检测胶体金的快速检测上，该技术可省略了猪血浆/血清分离的步骤，节省了检测成本、时间，具有较高的应用价值。
94.3.抗红细胞单克隆抗体拦截猪全血效果与常规处理方法比对
95.采集2份新鲜的猪全血10ml，分别取5ml置于15ml无菌离心管中，4℃条件下3000r/min离心10min后取上清备用。将抗猪红细胞鼠单克隆抗体3b6用ph＝7.6、0.01m的tb包被缓冲液稀释成15、30、60μg/ml，tb包被缓冲液中含有1％的bsa封闭蛋白、0.01％的triton-x-100表面活性剂。将包被缓冲液稀释后的抗体喷在硝酸纤维素膜上，在37.0℃
±
2.0℃的干燥箱内干燥10小时后，按照胶体金试纸条的结构组配成层析纸条，层析纸条使用铝箔袋密封后室温保存备用(方法同实例3中的实验2)。阴性对照为不含抗猪红细胞抗体的试纸条。结果见图5，两份猪全血样本分别编号a和b，抗猪红细胞抗体包被浓度在15μg/ml时其拦截猪全血的效果已达到常规离心处理法水平，效果优于市面上其他猪全血抗体。综上所述，本发明所获得的3b6鼠单克隆抗体可用在猪全血检测胶体金的快速检测上，该技术可省略了猪血浆/血清分离的步骤，节省了检测成本、时间，具有较高的应用价值。
96.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。