本发明涉及发酵工程，具体涉及一种耐高渗透压菌种筛选方法及在谷氨酸发酵中的应用。
背景技术：
1、l-谷氨酸(l-glutamate)，化学名称为α-氨基戊二酸，分子式为c5h9no4，分子量为147.13076，分子中含有两个羧基，是一种酸性氨基酸。广泛应用于食品、医药、日化及饲料等工业领域。
2、谷氨酸目前的生产方法是发酵法生产，微生物合成谷氨酸途径是葡萄糖经过糖酵解途径(emp)和磷酸己糖支路(hmp)生成丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶a；然后在醛缩酶的催化下，草酰乙酸和乙酰辅酶a合成柠檬酸，进一步生成异柠檬酸和α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶及nh4+存在下生成谷氨酸，菌体内合成的谷氨酸透过细胞膜，便能在发酵液中积累大量的谷氨酸。
3、目前影响谷氨酸行业发展的主要问题是使用的谷氨酸生产菌株随着工艺技术的不断优化提升，生产过程中发酵液的谷氨酸浓度不断提高，渗透压也不断升高，从而抑制菌体活性，导致发酵中后期耗糖、产酸能力下降。目前常用的方法包括从工艺出发通过加入渗透压调节物质甜菜碱等维持胞内离子平衡从而缓解渗透压升高对菌体活性的抑制；也有通过半连续或连续发酵工艺来减缓发酵过程中渗透压的升高；也有从菌种出发，通过传统的诱变育种或者分子改造方法以提高菌种的抗逆能力。由于谷氨酸棒杆菌抵御高渗透压胁迫的潜在机制还不清晰，因此还没有特定的分子改造靶点，同时采用传统的诱变育种方法是随机突变，筛选难度大，无法定向获得耐渗菌株。
4、最接近现有技术：
5、中国专利cn101705262a公开了一种利用甜菜碱提高谷氨酸温度敏感突变株发酵产酸率的新工艺。本发明涉及一种利用温度敏感突变株发酵生产l-谷氨酸的改进方法。本发明根据甜菜碱在谷氨酸发酵过程中具有提供甲基、调节菌体细胞内渗透压、促进菌体脂肪代谢和蛋白质合成等作用，可提高菌体内酶活，促进菌体生长，实现谷氨酸在发酵液中的更大程度蓄积从而提高产率的原理，采用在发酵培养基中添加甜菜碱或磷酸盐甜菜碱的方法，来有效提高l-谷氨酸发酵产率。
6、中国专利cn111621530a公开了一种半连续发酵生产谷氨酸的方法及系统，种子培养；温敏谷氨酸菌种在30-32℃、ph7.0-7.1条件下培养制备菌种种子液；发酵培养：菌种种子液接入培养基中，采用半连续式发酵，在发酵过程中流加补料。本发明采用的利用温敏谷氨酸半连续发酵工艺能够延长谷氨酸产酸周期，避免了发酵液中谷氨酸积累对菌体的抑制作用，及提高发酵液中氧、营养素传递速率，与现有发酵工艺相比，能够整体缩短发酵周期，提高发酵效率，同时单罐发酵液谷氨酸含量得到了极大的提升。
7、中国专利cn113981019a公开了一种提高谷氨酸发酵速率的工艺，其包括如下步骤：将温度敏感型谷氨酸棒杆菌菌种种子液接种到发酵培养基中，2h开始流加体积分数为60％的全营养培养基，持续流加24h，停止流加，发酵总时间为28-32h；从发酵12h时进行放料直至发酵结束，放料速度与流加培养基的速度保持一致。本发明能够提升发酵速率、提高单罐发酵产能、降低发酵过程中能物耗消耗。
8、中国专利cn111088203a公开了一种产赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用，通过在谷氨酸棒杆菌中过表达adp葡萄糖焦磷酸化酶，提高了糖原合成速度，使得谷氨酸棒杆菌得以快速响应高渗胁迫，从而提高了谷氨酸棒杆菌生长速度和赖氨酸产量，缩短了发酵周期。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种耐高渗透压菌种筛选方法及在谷氨酸发酵中的应用。
2、本发明的技术方案是这样实现的：
3、本发明提供一种耐高渗透压菌种筛选方法，包括以下步骤：
4、(1)菌种活化：将菌株接种于斜面培养基中活化，培养长出菌苔；
5、(2)菌种种子液的制备：从新鲜活化的斜面培养基上挑取菌苔，接种于种子培养基中，于振荡培养至对数生长中后期，制得菌种种子液；
6、(3)初次传代驯化：以渗透压为2000-3000mosmol/kg驯化培养基a进行初次驯化培养，然后转入新鲜驯化培养基a进行连续传代的驯化培养，驯化培养7-9代；
7、(4)二次传代驯化：将步骤(3)制备发酵液接种至渗透压为3000-4000mosmol/kg驯化培养基b进行二次连续传代驯化。再进行7-9代的高渗培养基的连续传代；
8、(5)平板初筛：将步骤(4)制得的发酵培养液涂至平板培养基上，培养长出菌苔，挑选生长占优势的单菌落；
9、(6)摇瓶复筛：将步骤(5)中平板初筛中生长优良的菌落进行挑选，选出其中较优的15-25组，采用摇瓶进行初次复筛，筛选获得生长和耗糖快的菌株，从而得到耐高渗透压菌种。
10、作为本发明的进一步改进，步骤(1)中所述培养条件为30-35℃，培养20-28h。
11、作为本发明的进一步改进，步骤(2)中所述菌种种子液培养条件为：罐压0.05-0.8mpa，通气量10-20l/min，搅拌200-600rpm，ph7.0-7.2；温度控制33℃，通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌，溶氧维持30-50％。
12、作为本发明的进一步改进，步骤(3)中所述驯化培养基a的配方：葡萄糖40-50g/l、酵母粉10-20g/l、氨基酸粉10-20g/l、谷氨酸盐100-120g/l、海藻糖5-10g/l、氯化钾10-20g/l、硫酸镁1-2g/l、消泡剂0.3-0.5ml/l、生物素0.4-0.5mg/l，余量为水。
13、作为本发明的进一步改进，步骤(4)中所述驯化培养基b的配方：葡萄糖40-50g/l、酵母粉10-20g/l、氨基酸粉10-20g/l、谷氨酸盐160-170g/l、海藻糖10-20g/l、氯化钾20-30g/l、硫酸镁1-2g/l、消泡剂0.3-0.5ml/l、生物素0.4-0.5mg/l，余量为水。
14、作为本发明的进一步改进，步骤(5)中所述平板培养基的配方：鱼蛋白胨5-15g/l、酵母粉2-7g/l、nacl5-15g/l、琼脂15-20g/l、葡萄糖5g/l、氯化钾20-30g/l、海藻糖5-10g/l。
15、作为本发明的进一步改进，所述谷氨酸盐为谷氨酸钠、谷氨酸钾或者谷氨酸铵；所述酵母粉的总氮含量为15-20g/l；所述氨基酸粉的总氮含量为10-15g/l；所述海藻糖的含量为＞98％。
16、作为本发明的进一步改进，步骤(3)、(4)中的条件为：罐压0.05-0.1mpa，通气量10-30l/min，搅拌200-800rpm，ph6.9-7.2；温度控制33-40℃，过程残糖控制：流加糖68％，过程控制残糖0-0.5％，通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌，溶氧维持20-50％。
17、作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
18、(1)菌种活化：
19、将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于斜面培养基中进行活化，于33℃下培养24h后长出菌苔；
20、(2)菌种种子液的制备：
21、从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于种子培养基中，于33℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期，培养时间为12h，制得菌种种子液；
22、(3)初次传代驯化：
23、以渗透压2500mosmol/kg的驯化培养基a进行初次传代驯化：
24、3.1)以10％的接种量将上述(2)制备菌种种子液接种至装有20ml驯化培养基a的500ml摇瓶中，放到往复式摇床上，在33℃，220rpm振荡培养24h；
25、3.2)将步骤(3.1)培养24h后，以10％的接种量将步骤(3.1)制得发酵培养液接种至装有20ml驯化培养基a的500ml摇瓶中，放到往复式摇床上，在33℃，220rpm振荡培养24h；
26、3.3)重复步骤(3.2)6次；
27、驯化培养基a的配方：葡萄糖40-50g/l、酵母粉10-20g/l、氨基酸粉10-20g/l、谷氨酸盐100-120g/l、海藻糖5-10g/l、氯化钾10-20g/l、硫酸镁1-2g/l、消泡剂0.3-0.5ml/l、生物素0.4-0.5mg/l，余量为水；
28、(4)二次传代驯化：
29、4.1)以10％的接种量将上述(3)制备发酵液接种至装有20ml的渗透压为3000-4000mosmol/kg的驯化培养基b的500ml摇瓶中，放到往复式摇床上，在33℃，220rpm振荡培养24h；
30、4.2)将步骤(4.1)培养24h后，以10％的接种量将步骤(4.1)制得发酵培养液接种至装有20ml驯化培养基b的500ml摇瓶中，放到往复式摇床上，在33℃，220rpm振荡培养24h；
31、驯化培养基b的配方：葡萄糖40-50g/l、酵母粉10-20g/l、氨基酸粉10-20g/l、谷氨酸盐160-170g/l、海藻糖10-20g/l、氯化钾20-30g/l、硫酸镁1-2g/l、消泡剂0.3-0.5ml/l、生物素0.4-0.5mg/l，余量为水；
32、4.3)重复步骤(4.2)6次；
33、(5)平板初筛：
34、将步骤(4)制备的发酵培养液涂至高渗透压的平板培养基上，于33℃下培养48h后长出菌苔，挑选生长占优势的单菌落；
35、平板培养基的配方：鱼蛋白胨5-15g/l、酵母粉2-7g/l、nacl5-15g/l、琼脂15-20g/l、葡萄糖5g/l、氯化钾20-30g/l、海藻糖5-10g/l；
36、(6)摇瓶复筛：
37、将步骤(5)平板初筛中生长优良的菌落进行挑选，选出其中较优的20组，采用摇瓶进行初次复筛，筛选获得生长和耗糖快的菌株，从而得到耐高渗透压菌种。
38、本发明进一步保护一种上述的耐高渗透压菌种筛选方法筛选的耐高渗透压菌种用于谷氨酸的发酵中的应用。
39、本发明进一步保护一种耐高压菌种mhz-0116，所述菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no:25261。
40、本发明具有如下有益效果：
41、(1)本发明使用特定的驯化培养基进行传代培养，采用不同梯度渗透压进行逐级驯化，此种方法针对性强，能够特异性获得耐高渗透压菌株，相比传统诱变的随机突变，能够定向进化，更加快速的获得目标菌株。
42、(2)本发明相比于添加渗透压相容性物质甜菜碱、半连续和连续发酵工艺，能够从根本解决菌种渗透压耐受问题，节省成本，工艺操作简单。
43、(3)本发明获得的渗透压耐受菌株，应用于谷氨酸发酵，发酵理论酸提升22-25％。