基于猪繁殖与呼吸综合征ORF2a基因的RT-RPA荧光型建立方法

本发明涉及了检测，具体的是基于猪繁殖与呼吸综合征orf2a基因的rt-rpa荧光型建立方法。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)临床症状表现为仔猪呼吸障碍、母猪繁殖障碍、肺部出血、免疫抑制等。猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，prrsv)是一种单股正链的rna病毒，属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，根据基因型分为欧洲型(prrsv-1)和美洲型(prrsv-2)；prrsv全长基因组大约在15kb左右，包含10个开放阅读框(orf)，编码14个非结构蛋白和7个结构蛋白。病毒粒子为直径大小在50-80nm之间的球形或椭圆形，具有囊膜且表面有微绒毛样突起。

2、在早期对prrs的监测和预防非常关键，而构建一种能够快速检测prrsv的rt-rpa荧光型方法对prrs的监测和预防具有重要意义。

3、rt-rpa是重组酶介导的扩增技术结合逆转录酶m-mlv及荧光定量pcr仪的检测方法，rpa是在重组酶介导聚合酶在等温条件下对目标序列进行扩增的等温扩增技术，rna在逆转录酶m-mlv作用下反转成cdna，dna/cdna能够在短时间内扩增109-1012倍，扩增产物所带的荧光基团释放荧光信号，根据扩增产物的浓度及荧光信号强度显示出不同程度的扩增曲线，且扩增曲线在15min内起峰均判断为阳性。rpa恒温扩增技术在各行业已成为热点，荧光定量pcr仪在食品安全监测、人畜病害防治、植物病害诊断等领域广泛应用，许多猪养殖场也配备了荧光定量pcr仪。

4、由于prrsv orf2a能够编码次要结构蛋白gp2a，该蛋白在病毒侵入结合受体时起到关键作用，因此根据orf2a序列相对保守区域设计正反向引物及探针，构建prrsv orf2a序列的rt-rpa荧光型检测方法，快速高效的对prrs监测、防控，有利于维持猪种群的健康和猪养殖业的稳定发展。

技术实现思路

1、本发明涉及的一种用于检测prrsv的rt-rpa荧光型引物和探针，包括rpa-orf2a引物对和rpa-orf2a探针，其特征在于，所述rpa-orf2a引物对的上游引物核苷酸序列为：5'-agcttcacgattttcagcaatggct-3'，下游引物核苷酸序列为：5'-acgtagcattggaattcgcaaccac-3'；

2、所述rpa-orf2a探针为，

3、5'-aatagctgtacattcctccatattttct(hex-dt)c(thf)g(bhq1-dt)tgcagcttcttgt-c3 spacer。

4、本发明还提供一种检测prrsv的rt-rpa扩增试剂，所述的rt-rpa扩增试剂包括上述引物和探针。

5、进一步地，所述rt-rpa扩增试剂还包括primerfree rehydrationbuffer、depc处理水和dna/rna样本。

6、本发明还提供一种检测prrsv的rt-rpa扩增试剂在检测prrsv的应用，包括rt-rpa扩增方法，

7、s1、构建51μl的扩增体系，首先将primerfree rehydrationbuffer29.5μl、上游引物(10μm)2.1μl、下游引物(10μm)2.1μl、探针(10μm)0.6μl，逆转录酶m-mlv 1μl及depc处理水加至43.5μl，上述溶液全部加入至有反应干粉的检测单元管中；

8、s2、向检测单元管中加入经处理的dna/rna样本5.0μl；

9、s3、再向检测单元管盖上加入2.5μl的mgoac，盖上管盖(透明管盖)，上下颠倒及轻微振荡充分混匀5-6次，低速离心10s；

10、s4、将检测单元管放入荧光定量pcr仪中，进行荧光检测。

11、进一步地，还包括构建阳性质粒，所述阳性质粒的构建方法包括：

12、a1、扩增目的基因：以prrsv全长质粒pok-xh-gd为模板克隆扩增orf2a基因，

13、用正向引物f：tagtaagcttatgaaatggggtccatg；

14、反向引物r：tagtctcgagccatgagttcaaaagaaaagt，进行pcr扩增，扩增体系为100μl：高保真酶(primestar max premix(2×))50μl，上下游引物各0.5μl，ddh2o 47μl，dna 2μl，解链94℃，退火57℃，延伸72℃，30个循环，pcr扩增产物在1％琼脂糖凝胶(含eb核酸染料)进行电泳，在1×tae缓冲液中电压100v电泳1h，电泳结果在凝胶成像系统中拍照记录。

15、a2、胶回收：

16、a2.1、将含有目的条带的凝胶切下称重，以1g/ml的比例加入xp2 bindingbuffer，在50-60℃下放置7min直至将胶完全融化；

17、a2.2、融化后吸取700μl至过滤柱，12000rpm离心1min，弃收集管中液体，重复步骤b2.2至液体加完；

18、a2.3、加入300μl xp2 buffer，12000rpm离心1min，弃收集管中液体。

19、a2.4、加入spw buffer 700μl，12000rpm离心1min，弃收集管中液体；

20、a2.5、以12000rpm12000 rpm将空的过滤柱离心2min，将过滤柱放置于无菌1.5ml离心管，加入预热的elution buffer或ddh2o 15-30μl至过滤膜中央，室温静置2min，12000rpm离心1min，测浓度，-20℃保存。

21、a3、连接：胶回收产物与载体pmd18-t 16℃过夜连接，10μl体系：1μl pmd18-t(0.03pmol/50ng)，dna与载体摩尔比1：2～10，灭菌水加至5μl，5μl solution i，获得连接产物；

22、a4、转化：连接产物与dh-5α1：10比例加至灭菌离心管内冰浴30min，42℃90s,再冰浴2min，加入500μl无抗lb液体培养基，放置于摇床37℃下以160rpm速度培养45min，3000rpm离心1min，弃400μl上清液，剩余菌液涂布于含氨苄青霉素的lb固体培养基，37℃培养16h；

23、a5、质粒提取：用枪头挑起单菌落，将枪头打入含氨苄青霉素的lb液体培养基内，放摇床37℃下以200rpm的速度处理6h，再吸取10μl菌液加入10ml氨苄青霉素的lb液体培养基内二次培养，37℃下以200rpm的速度处理16h，菌液即可提取质粒，提取步骤如下：

24、a5.1、吸取菌液至1.5ml无菌离心管内12000rpm 1min，弃上清液；

25、a5.2、加250μl buffer p1(已加rnase a)，吹打混匀沉淀，使菌液充分裂解；

26、a5.3、加250μl bufferp2，温和上下颠倒8-10次(溶液变得粘稠而透亮，开盖有拉丝，此步骤控制在2-3min内)；

27、a5.4、加350μl buffer p3，立即温和地上下颠倒8-10次，出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；

28、a5.5、吸附柱放置在收集管中，将以上步骤的上清转移至吸附柱中，不要吸到沉淀，12000rpm离心1min，弃液；

29、a5.6、加入600μl bufferpw2(已加入无水乙醇)至吸附柱中，12000rpm离心1min，弃液；

30、a5.7、重复步骤b5.6；

31、a5.8、12000rpm离心1min；

32、a5.9、吸附柱放置在新的无菌离心管中，加入30-100μl预热的elution buffer或ddh2o至膜中央，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃去吸附柱，测试dna产物浓度后保存于-20℃，获得阳性质粒。

33、进一步地，还包括通过稀释阳性质粒获得多个阳粒子测试样本，然后采用rt-rpa扩增方法对所述阳粒子测试样本进行测试，对rt-rpa扩增方法的敏感性进行判断。

34、进一步地，还包括获得毒株作为检测样本，然后通过rt-rpa扩增方法进行特异性测试。

35、在对prrsv检测过程中，包括：

36、1.使用核酸提取试剂盒结合vazyme全自动核酸提取仪提取待测样品的prrsv基因组rna，提取步骤如下：

37、1.1处理样本：组织样品加入1ml无菌pbs缓冲液研磨后待用；拭子样品加入1ml无菌pbs缓冲液，拭子在离心管内涮后弃，液体样品待用；血样可直接用于核酸提取。待提样品体积为200μl，不足则加入pbs至200μl。

38、1.2取出预封装试剂，颠倒混匀数次使磁珠重悬，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部，使用前确认板子方向并小心撕去铝箔封口膜(撕封口膜时避免振动，防止液体溅出)。

39、1.3自动化仪器提取：在96孔板试剂第1列和第7列孔中先后加入200μl样品和20μlproteinase k溶液；将96深孔板放入核酸提取仪中，装入磁棒套，按照程序自动化提取。

40、2.以步骤1提取的待测样品dna/rna为模板，以所述特异性引物rpa-orf2a作为扩增引物，进行等温扩增。

41、扩增体系(51μl)：primer free rehydration buffer 29.5μl，正反向引物(10μm)各2.1μl，探针(10μm)0.6μl，逆转录酶m-mlv 1μl，模板dna/rna 5μl，depc处理水3μl，mgoac2.5μl。

42、扩增条件：恒温39℃，预热30s，，39个循环，每个循环30s。

43、加样操作：将primer free rehydration buffer、正反向引物、探针、模板及depc处理水混匀后加入反应干粉中，再混匀，然后加入mgoac后振荡混匀并离心10s，放入荧光定量pcr仪中进行扩增。

44、3.检测结果判定：扩增反应结束后，根据荧光定量pcr仪中的扩增曲线，在15min内起峰均为有效阳性结果。

45、本发明的有益之处在于：由于prrsv orf2a能够编码次要结构蛋白gp2a，该蛋白在病毒侵入结合受体时起到关键作用，因此根据orf2a序列相对保守区域设计正反向引物及探针，构建prrsv orf2a序列的rt-rpa荧光型检测方法，能够，快速高效的对prrs监测、防控，有利于维持猪种群的健康和猪养殖业的稳定发展。

46、为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。