一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用。

背景技术：

1、纤维素是地球上含量最丰富、分布最广泛的可再生能源物质。利用微生物来源的纤维素酶将纤维素转化为生物燃料或制备具有高附加产值的工业产品，为缓解当前世界所面临的环境污染和能源短缺提供了一个有效途径。然而，现有纤维素酶存在活力低、酶解效率有限、稳定性差、产率低等问题一直制约着纤维素酶的工业化。因此，挖掘新型高效的纤维素酶具有十分重要的意义。尽管利用传统的微生物培养方法已筛选到大量高效产纤维素酶的菌株，但自然环境中的大多数微生物仍不可培养。而宏基因组技术避开了传统的微生物培养方法，直接对所有环境样本中的微生物基因组信息进行研究，打破不可培养微生物的操作壁垒。因此，通过宏基因组技术有望最大限度的挖掘自然界的活性酶基因，获得新颖的纤维素酶。

2、纤维素是自然界中储量丰富、价格低廉的可再生生物质原料，对解决全球能源危机问题具有巨大应用潜力，但其结构复杂，难以降解，导致综合利用率较低。现阶段工业化生产生物质能源的主要难点在于高效的纤维素生物质降解酶的匮乏。虽然通过微生物体外培养技术已经筛选出许多优良的纤维素酶基因，但仍有大量不可培养微生物的纤维素酶基因有待挖掘。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用。纤维素酶zfeg1907，其核苷酸序列如seq id no.1所示，截短体zfeg1907t为seq id no.1所示核苷酸序列去除底物结合结构域(pkd-fn3)余下的催化功能序列，其核苷酸序列如seq id no.2所示，纤维素酶的底物结合结构域基因序列pkd-fn3，核苷酸序列如seq id no.3所示。本实验课题避开传统的微生物直接培养方法，利用宏基因组学技术挖掘研究珠穆拉玛峰土壤宏基因组文库中新颖、高效的纤维素酶基因，将筛选到的纤维素酶基因异源表达及蛋白纯化获得纤维素酶后，接着分析其酶学特性与动力学性质。本研究筛选的新型、高效纤维素酶不仅能丰富现有的纤维素酶资源库，还可为提高木质纤维素利用效率提供参考依据。新纤维素酶seq id no.1对应的酶蛋白发现，用以催化水解纤维素类降解；另外seq id no.3有助于底物结合。因此，深入挖掘产纤维素酶基因并实现其高效表达具有非常重要的现实意义。

2、实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明提供一种纤维素酶基因序列，其核苷酸序列如seq id no.1所示，或核苷酸序列由seq id no.1所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。

4、纤维素酶阳性克隆筛选后，纤维素酶阳性亚克隆构建，对阳性亚克隆测序结果使用snapgene viewer 4.1.9.0软件进行分析，预测获得一个全长为2118bp的 orf(核苷酸序列由seq id no.1所示)，该序列的gc含量为69％，编码705 个氨基酸组成的蛋白，预测其分子量为75.3kda，预测等电点pi为6.02。将预测的orf上传到ncbi数据库进行balstx同源性比对，结果显示该基因所编码的蛋白属于糖苷水解酶第四十四家族(gh44)，且与来源于梨单胞菌科细菌 76.38％的相似性(mba3515422.1)，与来源于装甲菌门的细菌有73.17％的相似性(mcc2671073.1)，与来源于酸杆菌门的细菌有63.65％的相似性(ahl27901.1)。比对结果表明，该orf编码的蛋白质是潜在的纤维素酶，命名该基因为 zfeg1907(核苷酸序列由seq id no.1所示)。对该基因编码的纤维素酶 zfeg1907、gh44家族以及其他gh家族的部分纤维素酶经clustalw进行多序列比对，并利用mega5.1构建系统发育进化树。通过建立进化树，进一步确定 zfeg1907属于gh44家族。将zfeg1907序列提交swiss-prot数据库分析蛋白质结构，获得相似度最高的模板3ii1.1，与该模板相比一致性为76.25％，该模板对应的蛋白质为gh44家族纤维素酶celm2(abl11223.1)

5、优选的是，所述核苷酸序列由seq id no.1所示核苷酸序列去除底物结合结构域余下的催化功能序列，催化功能序列如seq id no.2所示，或由seq id no.2所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。

6、上述任一方案中优选的是，所述seq id no.2所示核苷酸序列由seq id no.1所示核苷酸序列去除最后561个碱基对核酸获得。

7、本发明还公开上述纤维素酶基因的扩增，设计特异性引物zfeg1907-f和zfeg1907-r(引物序列p1907-f(5’-ttt aag aag gag ata tac ata tgc aga acc ccg ccgtcaaca tca-3’)和p1907-r(5’-gtg gtg gtg gtg gtg gtg ctc gag tct ctt aag agttct ggc gcc cgc-3’)对纤维素酶基因 zfeg1907进行pcr扩增；构建质粒表达蛋白zfeg1907t使用特异性引物 zfeg1907t-f和zfeg1907t-r对纤维素酶基因zfeg1907进行校正pcr扩增；对目的条带回收纯化。

8、本发明还公开上述纤维素酶基因的诱导表达和纯化方法，包括：

9、(1)通过在液体lb培养基中加入诱导剂iptg对重组质粒 pet-30a(+)-zfeg1907及pet-30a(+)-zfeg1907t进行低温诱导表达；

10、(2)在大肠杆菌e.coli bl21(de3)中对重组质粒pet-30a(+)-zfeg1907和 pet-30a(+)-zfeg1907t进行诱导表达，对目的蛋白进行纯化。

11、经过镍柱亲和层析纯化，成功获得纯纤维素酶zfeg1907及zfeg1907t。

12、本发明还公开上述纤维素重组酶活力及稳定性的影响研究，包括以下方法：

13、(1)温度对纤维素重组酶活力及稳定性的影响；

14、(2)ph对纤维素重组酶活力和稳定性的影响；

15、(3)金属离子和化学试剂对纤维素重组酶活力的影响。

16、温度对纤维素重组酶活力及稳定性的影响研究结果：纤维素酶zfeg1907 和截短体zfeg1907t的酶活性随着温度的升高而逐渐升高，在40℃-50℃范围内均有较高活性，50℃时酶活性均达到最大，当温度高于50℃时，纤维素酶的活性随着温度的升高而不断下降。70℃时纤维素酶zfeg1907的酶活降低至最高酶活的43％，纤维素酶zfeg1907t的酶活降低至最高酶活的61％。综上，纤维素酶zfeg1907和截短体zfeg1907t的最适反应温度为均为50℃，属于嗜热酶，具有广阔的工业应用前景。

17、ph对纤维素重组酶活力和稳定性的影响研究结果：纤维素酶zfeg1907和截短体zfeg1907t的最适反应ph均为5.0。纤维素酶zfeg1907和截短体 zfeg1907t的ph稳定性大体相似。二者在ph 4.0-8.0相对稳定，均能保持50％以上的活性。纤维素酶zfeg1907在ph 3.0及ph 9.0的条件下处理后依然保持 40％以上活性，而截短体zfeg1907t在ph 3.0及ph 9.0条件下处理后在其活性均低于30％以下，说明纤维素酶zfeg1907的ph稳定性比其截短体zfeg1907t 强。

18、金属离子和化学试剂对纤维素重组酶活力的影响研究结果：1mm的金属离子除cu2+和mn2+对zfeg1907和截短体zfeg1907t酶活力均有一定的抑制作用， mg2+和ca2+对zfeg1907t酶活力均有一定的促进作用外其他金属离子对该酶的活性影响不明显；1％的有机溶剂除乙腈、乙醇、丙酮和甲醇对zfeg1907酶活力均有一定的抑制作用，乙腈、丙酮、甲醇和乙酸乙酯对zfeg1907t酶活力均有一定的促进作用外其他化学试剂对该酶的活性影响不明显。

19、本发明还公开一种纤维素酶的底物结合结构域基因序列，底物结合结构域为pkd-fn3，pkd-fn3核苷酸序列如seq id no.3所示，或由seq id no.3所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和 /或缺失和/或添加和/或移位。

20、利用pfam网站预测zfeg1907可能存在的催化以及底物结合相关结构域，并同时预测gh44家族其他的纤维素酶结构域，与zfeg1907进行比较。结果表明，zfeg1907蛋白中除了含有gh44家族的催化结构域外还含有pkd及fn3 二个结构域。

21、本发明还公开一种上述所述的底物结合结构域基因序列在促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性、提高酶的催化效率方面的应用。

22、优选的是，所述底物至少包括羧甲基纤维素钠(cmc-na)、魔芋胶(kgm)、地衣多糖(lichenan)。实验结果显示，pkd-fn3结构域能够通过提高对cmc、 kgm和lichenan三种底物的结合能力来提高纤维素酶zfeg1907的催化效率。因此，纤维素酶zfeg1907的pkd-fn3结构域有助于促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性。

23、本发明还公开一种纤维素酶，其氨基酸序列由上述seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3中任意一项所述的核苷酸序列编码，或由seq id no.1、seq id no.2或seq idno.3所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。

24、本发明还公开一种重组载体，含有seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3 中任意一项所示的核苷酸序列。所述的载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。本发明中，编码纤维素酶的核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。

25、优选的是，该重组载体的表达载体为大肠杆菌。在大肠杆菌e.coli bl21(de3) 中对重组质粒pet-30a(+)-zfeg1907和pet-30a(+)-zfeg1907t进行诱导表达。

26、本发明还公开一种上述所述的纤维素酶在降解羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖或微晶纤维素、羧甲基纤维素钠中的应用。最适条件下测定的纤维素酶 zfeg1907和截短体zfeg1907t底物特异性检测，纤维素酶zfeg1907和截短体 zfeg1907t表现出相似的底物特异性。两酶只在羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖、微晶纤维素这四种底物中表现出降解活性，且对魔芋胶的活性最高，其次是地衣多糖和羧甲基纤维素钠，而对刺槐豆胶、木聚糖、葡聚糖、茯苓多糖、瓜尔豆胶、几丁质、pnpg没有降解活性。

27、本发明具有以下有益效果：

28、本文以西藏土壤微生物宏基因组为研究对象，通过功能筛选方法从土壤宏基因组文库中挖掘纤维素酶阳性克隆，应用生物信息学分析克隆中潜在的纤维素酶基因，并利用生化实验进一步对纤维素水解酶进行酶学及结构域功能研究。为纤维素酶在工业上的应用提供坚实的理论基础。主要研究内容及结果分述如下：

29、(1)基于功能宏基因组学策略从土壤文库中获得一个新型纤维素酶基因，命名为zfeg1907，核苷酸序列如seq id no.1所示。该基因全长2118bp，序列 gc含量为69％，编码705个氨基酸组成的蛋白，预测其分子量为75.3kda，预测等电点pi为6.02；同源性分析结果显示，该基因所编码的蛋白属于糖苷水解酶第44家族(gh44)，与来源于紫单胞菌科细菌的水解酶有76.38％的同源性。蛋白结构预测表明，zfeg1907蛋白中除了含有gh44家族的催化结构域外还含有pkd及fn3结构域。

30、(2)了阐明zfeg1907蛋白中pkd-fn3结构域在该纤维素酶结构中的功能，构建pkd-fn3结构域缺失型纤维素酶zfeg1907t，核苷酸序列如seq id no.2 所示。通过将目的基因片段与表达载体pet-30a(+)连接，在蛋白羧基端融合6× his标签，选用e.coli bl21(de3)作为蛋白的表达宿主菌进行目的基因的异源表达。经过镍柱亲和纯化，分别得到zfeg1907以及zfeg1907t目的蛋白， sds-page电泳结果显示分子量分别与预测值大小一致。

31、(3)重组蛋白酶学性质结果显示，纤维素酶zfeg1907及截短体zfeg1907t 的最适温度均为50℃，在40℃以下热稳定性较好。二者的最适ph均为5.0，在中性及偏酸性条件(ph4.0-6.0)下有较高的酶活，且稳定性较好，是一个嗜酸性酶。cu2+和mn2+(1mm和10mm)对两者均有明显的抑制作用，mg2+(1mm及 10mm)和ca2+(1mm)对zfeg1907t酶活力均有明显的促进作用，k+(10mm) 对zfeg1907有明显的促进作用；1％乙腈和1％甲醇对纤维素酶zfeg1907有明显的抑制作用，15％的有机溶剂对zfeg1907及zfeg1907t酶均有一定的抑制作用，且对zfeg1907酶的抑制作用更显著。而sds作为一种强变性剂，无论浓度高低均对zfeg1907和zfeg1907t的酶活力均有明显抑制作用。100mm的咪唑显著抑制zfeg1907和zfeg1907t的活性。

32、(4)对重组蛋白酶进行底物特异性及动力学参数分析，结果显示zfeg1907 及截短体zfeg1907t表现出相似的底物特异性，两者只在羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖、微晶纤维素这4种底物中表现出水解活性，且对魔芋胶的活性最高。对羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖三种底物做酶促动力学参数测定，结果显示以羧甲基纤维素钠为反应底物时，纤维素酶zfeg1907的km值比 zfeg1907t低42.27％，kcat/km值比zfeg1907t高35.85％。以魔芋胶为反应底物时，纤维素酶zfeg1907的km值比zfeg1907t低33.79％，kcat/km值比zfeg1907t高 70.08％；以地衣多糖为反应底物时，纤维素酶zfeg1907的km值比zfeg1907t低61.62％，kcat/km值比zfeg1907t高92.73％。以上结果表明：pkd-fn3结构域能够通过提高对羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖三种底物的结合能力来提高纤维素酶zfeg1907的催化效率。纤维素酶zfeg1907(核苷酸序列如seq id no.1所示)和截短体zfeg1907t(核苷酸序列如seq id no.2所示)的最适反应温度为均为50℃，属于嗜热酶，具有广阔的工业应用前景。

33、(5)综上，通过基于功能宏基因组学策略从西藏土壤文库中获得一个新型纤维素酶基因zfeg1907，其蛋白zfeg1907中除了含有gh44家族的催化结构域外还含有pkd-fn3结构域。将目的基因与载体pet-30a(+)连接，在e.coli bl21(de3)中异源表达得到蛋白zfeg1907和pkd-fn3结构域缺失型蛋白 zfeg1907t。重组蛋白酶学特性研究结果表明pkd-fn3结构域对纤维素酶的常规特性(最适温度、最适ph、金属离子和化学试剂耐受性、底物特异性)几乎没有影响。但pkd-fn3结构域能够通过提高对羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖三种底物的结合能力来提高纤维素酶zfeg1907的催化效率。所以纤维素酶 zfeg1907的pkd-fn3结构域有助于促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性。pkd-fn3结构域(核苷酸序列如seq id no.3所示)能够通过提高对cmc、kgm和lichenan三种底物的结合能力来提高纤维素酶zfeg1907 的催化效率。因此，纤维素酶zfeg1907的pkd-fn3结构域有助于促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性。