一种检测牛冠状病毒的实时定量RT-LAMP引物组及试剂盒的制作方法

本发明涉及微生物检测，具体说是涉及一种快速并且可实时定量检测牛冠状病毒的lamp引物组及试剂盒。

背景技术：

1、牛冠状病毒(bovine coronavirus，bcov)可以引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道疾病，该病毒在世界范围内流行，给养牛业造成了巨大的经济损失。目前该病在美国、澳大利亚、巴西、加拿大、泰国、英国、瑞典和以色列均有报道，犊牛患病48小时内排出大量的病毒粒子，一般可持续14天左右。临床转归期的犊牛在数周内还可能持续排毒。据报道，在病畜的鼻腔分泌物、肺和粪便中均可检测到病毒。在牛群中，病毒通过粪便和呼吸出的气溶胶进行传播。患病犊牛主要表现为出血性小肠结肠炎，腹泻多发生在1～2周龄。在自然条件下，犊牛冠状病毒病的发病率为15％～70％。成年牛的潜伏期为2～8天，急性阶段会持续3～6天，发病率为50％～100％，死亡率一般低于2％。以急性腹泻、发烧和产奶量减少为主要特征。无论是犊牛还是成年牛感染，都会引起牛呼吸道综合征。1985年宋广林在我国首次分离到该病毒。在我国，有关牛冠状病毒病的血清流行病学的资料较多，1990年姚火春等应用ha/hi方法检测牛血清样本，结果显示，阳性率为44.3％～80.2％。检测bcov的方法主要有中和试验、hi试验和间接免疫荧光试验、rt-pcr分子生物学诊断法以及病原分离。尽管中和试验特异性和敏感性较高，但存在操作烦琐、诊断周期长的缺点；hi试验存在主观性强，对判定结果的解释难以标化，不适合大批量检测等缺点；间接免疫荧光试验，对操作者技术要求高和需要昂贵设备，不利于推广；而且传统方法多以全病毒为抗原，存在很大的散毒危险。bcov通过分离病毒，采用电子显微镜方法检测病毒时，常因准确度低而不易准确鉴定。由于bcov很难分离，病毒分离并不是常用的诊断方法。部分诊断试验是基于病毒的血凝特性进行的，实验室可以利用血凝(ha)试验和血凝抑制(hi)试验技术来检验bcov。但是因为粪便样本中含有非特异性的血液凝集素，在进行ha试验时会产生干扰，需对ha试验进一步改进。采用elisa法进行诊断的话，由于其重复性不好，收自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性，感染因素比较多等缺点，因此，效果也不是很理想。采用rt-pcr耗时较长，敏感性稍低。因此，急需建立一种可以快速、准确检测和鉴定牛冠状病毒的方法具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测牛冠状病毒的实时定量rt-lamp引物组及试剂盒，以解决如何快捷准确检测鉴别牛冠状病毒的的问题。

2、为实现本发明目的所使用的技术方案为：

3、一种检测牛冠状病毒的实时定量rt-lamp引物组，所述的rt-lamp引物组包括seqid no：1～6所示的核苷酸序列；

4、所述seq id no：1、seq id no：2为外引物f3和b3；

5、所述seq id no：3、seq id no：4为内引物fip和bip；

6、所述seq id no：5、seq id no：6为环引物lf和lb。

7、优选地，所述的lamp引物组具有与seq id no：1～6所示的核苷酸序列中同源性为90％以上的序列。

8、优选地，所述的lamp引物组具有与seq id no：1～6所示的核苷酸序列中进行杂交的序列。

9、优选地，所述的lamp引物组具有与seq id no：1～6所示的核苷酸序列进行转录的序列。

10、优选地，所述的lamp引物组具有与seq id no：1～6所示的核苷酸序列进行优化截短的序列。

11、本发明还提供一种检测牛冠状病毒的实时定量rt-lamp试剂盒，包括lamp引物组、2×反应缓冲液、em、rnase-free water和牛冠状病毒rna模板。

12、优选地，所述2×反应缓冲液由buffer、dntps、mg2+组成。

13、优选地，所述lamp试剂盒的反应体系为25μl：其中包括12.5μl的2×反应缓冲液，1μl的em，1μl的seq id no：1，1μl的seq id no：2，1μl的seq id no：3，1μl的seq id no：4，1μl的seq id no：5，1μl的seq id no：6，2μl的牛冠状病毒rna模板，再加入水补足体系为25μl。

14、优选地，所述水为超纯水。

15、优选地，所述lamp试剂盒的应程序为：在63℃下恒温保持60min，扩增结束后85℃灭活5min。

16、与现有技术相比，本发明的显著进步是：

17、1)特异性强

18、所检测的其他病原、阴性对照均无阳性结果出来。

19、2)灵敏度高

20、利用本发明的牛冠状病毒lamp扩增引物组建立的lamp检测方法具有高度敏感性，检测限约为6.9×10-8ng/μl。

21、3)迅速得出结果

22、bcov的检测在实验室采用电子显微镜方法检测病毒时，常因准确度低而不易准确鉴定。由于bcov很难分离，病毒分离并不是常用的诊断方法。部分诊断试验是基于病毒的血凝特性进行的，实验室可以利用血凝(ha)试验和血凝抑制(hi)试验技术来检验bcov。但是因为粪便样本中含有非特异性的血液凝集素，在进行ha试验时会产生干扰，需对ha试验进一步改进。采用elisa法进行诊断的话，由于其重复性不好，收自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性，感染因素比较多等缺点，因此，效果也不是很理想。采用rt-pcr耗时较长，敏感性稍低。本发明提供的lamp检测方法在60分钟内即可完成扩增，且扩增结束即可判断结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析，从样品的基因组rna提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。

23、4)准确性高

24、目前建立的大多数lamp方法，在反应结束后打开反应管加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，或者通过跑电泳的方法进行结果判定，无法区分特异性扩增与非特异性扩增，因此增加了假阳性诊断结果的几率；而且对于弱阳性反应，通过人为肉眼判读的方式很可能误判为阴性。本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况，能够避免上述的缺陷，具有更高的准确性。

25、此外，利用本发明的牛冠状病毒lamp扩增引物组建立的lamp检测方法具有高度敏感性，高灵敏度保证了在样品rna含量极低的情况下，使用本发明牛冠状病毒的lamp扩增引物也可以扩增出目的rna片段，检测结果更准确。

26、5)不造成污染

27、常规的lamp方法在反应结束后通过凝胶电泳的方法来判读结果，或者开盖加入荧光染料进行判断，凝胶电泳使用的染料对环境也造成污染，且打开反应管容易造成实验室气溶胶污染。本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况，反应结束即可获得结果，不需要打开反应管的盖子，能有效避免气溶胶污染。

28、6)可实时定量

29、本发明利用tubidimeterreal-time la-320c浊度仪来实时分析lamp反应的结果，不同标准样品浓度的负对数及其对应的浊度值达到0.1所需的时间成线性关系，由此绘制标准曲线，获得标准曲线方程，即可进行定量检测。