一组具有抗病毒活性的肽类化合物奥米克欣A族化合物及其应用

本发明属于医药生物，具体而言，涉及一组具有抗病毒活性的肽类化合物奥米克欣a族化合物及其应用。

背景技术：

1、烈性病毒性感染是严重危害人类的传染性疾病。而每年在世界流行的由流感病毒感染引起的流行性感冒以及禽流感，其感染人群之广，致死数之大早已成为世界公共卫生安全不可忽视的问题，也是需要特别关注的。这些烈性病毒感染性疾病急需安全有效的广谱抗病毒，特别是抗冠状病毒药物对新型冠状病毒的有效治疗。

2、近期，分别在2019年1月24日《新英格兰医学》和1月29日《柳叶刀》发表的由我国ccdc等单位发表的有关2019-ncov冠状病毒的全基因测序显示，与sars冠状病毒只有79％的同源，其属于不同于sars冠状病毒的新冠状病毒。2019-ncov冠状病毒基因组可编码蛋白区的碱基长度为29844个碱基，编码12个蛋白：1ab,s,3,e,m,7,8,9,10b,n,13,和14。其中，1ab是编码一个由7096个氨基酸组成的非结构蛋白前体多聚蛋白的基因，s为编码刺突蛋白，还含有e、m和n蛋白等其它囊膜蛋白。一般来讲1ab编码的7096氨基酸的非结构前体多聚蛋白会被由病毒编码的蛋白酶3clpro和plpro切割形成16个非结构性蛋白(nonstructuralprotein,nsp)，大多数nsps参与病毒复制复合物的形成[1,2]。根据对sars冠状病毒和中东呼吸综合征冠状病毒mers等相关药物靶标研究，由2019-ncov冠状病毒基因组同源比对研究可知，2019-ncov可被利用的关键药物靶标有刺突蛋白与人的细胞膜上的血管紧张素转换酶2(ace2)的相互作用，即入胞机制，rna依赖的rna聚合酶rdrp，和负责水解由7096氨基酸组成的多聚蛋白为功能蛋白的半胱氨酸蛋白酶3clpro和plpro[3]。

3、流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链rna。依据其外膜血凝素(h)和神经氨酸酶(n)蛋白抗原性不同，目前可分为16个h亚型(h1～h16)和9个n亚型(n1～n9)[4]。其中，流感病毒表面血凝素(hemagglutinin,ha)在被宿主细胞内蛋白酶剪切成ha1和ha2之前是以前体蛋白ha0的形式存在，因此，宿主细胞蛋白酶对病毒感染至关重要[5]。

4、冠状病毒、流感病毒、副流感病毒等呼吸道相关病毒在进入呼吸道上皮细胞时，都需要利用宿主细胞的蛋白酶来切割、活化病毒蛋白，才能进入细胞进行复制[6]。因此这些宿主细胞编码的蛋白酶的抑制剂可能对这些呼吸道相关病毒具有广谱的抗病毒活性。更重要的是，针对宿主细胞的蛋白酶为靶点的抗病毒药物还可有效地避免病毒的逃逸变异。

5、微生物来源天然产物是新型抗感染抗生素的主要来源，据统计，在现有25000个具有一定生物活性的微生物次级代谢产物中，大约10％的微生物代谢产物具有抗各种病毒活性，如抗合胞病毒药物利巴韦林就来自于微生物次级代谢产物病毒唑，还有广谱抗病毒抗生素海绵尿核苷、阿糖尿苷和阿糖腺苷(vidarabine)以及磷霉素和formycin等也来自微生物天然产物或对微生物天然产物的改造等[7]。

6、从天然产物中寻找新的药物先导化合物一直是研究热点，相对于动植物的次级代谢产物，微生物次级代谢产物更具有资源可持续性、不破坏生态环境等特点，因此也拥有更大的开发利用价值。

7、早在上世纪60年代，医药生物技术研究所的科研前辈们从采自我国南方的土壤样品中，分离并筛选获得一株具有良好抗病毒活性的streptomyces sp.cpcc 200451，并使用经典的筛选方法与离子交换树脂柱层析法从cpcc 200451菌株发酵液中得到了其有效组分。曾作为抗人类流感病毒药物试用于临床试验，以提取物溶液制剂滴鼻的方式治疗流感病人，降低高烧，具有优良的效果。研究中还发现该有效组分对多种病毒，如流感病毒、冠状病毒、新城疫病毒等都表现出高度的敏感性，但是碍于当时的实验条件以及分离手段，且在分离过程中使用了强酸等剧烈条件，因此，一直不能得到streptomyces sp.cpcc 200451稳定而确切的药效成分，也就不能确定抗病毒活性成分的结构。

8、随着微生物全基因组dna测序技术的快速发展，越来越多的微生物基因组完成测序并已实现信息共享，加之，生物信息学和分子生物学等一系列前沿技术广泛应用于基因组研究领域，极大地加速了科研人员挖掘微生物基因资源的进程[8]。研究发现，微生物次级代谢产物的生物合成基因往往成簇排列，且具有高度的保守性。通过微生物基因组的生物信息学分析，发现与解析有关次级代谢基因簇，能够推测产物的结构及其理化性质，也可以指导目标化合物的分离纯化[9]。生物信息学的兴起，不仅为微生物药物的发展提供了新契机，而且在微生物新次级代谢产物的发现中发挥着十分重要的作用，更为我们解决cpcc200451产生的抗病毒活性化合物的鉴定这一难题提供了新的科研思路。

9、伴随“后基因组时代”的到来，以高通量测序为基础的转录组学、代谢组学等组学技术相继出现并得到广泛应用[10]。转录组学(transcriptomics)是研究生物体在某一功能状态下产生的所有转录本的集合，目前原核生物转录组测序的研究对象主要为mrna，通过比较不同发酵条件下微生物的转录组可以得到基因表达谱的变化情况，从而找到导致表达差异的生物合成基因信息[11,12]。结合基因组序列、生物信息学等分析技术，有助于定位目标代谢物的生物合成基因簇。代谢组学(metabonomics)是指生物体内源性代谢物质的动态整体，由于微生物在不同的发酵条件下可以产生不同的次级代谢产物，而代谢产物的多样性归功于生物合成基因的多样性，联合应用基因组学、转录组学以及代谢组学进行分析，不仅可以从现象中检测出差异的代谢产物，更从基因水平上解释了代谢产物变化的原因[13]。因此，通过对微生物在有活性的发酵条件下的转录组和代谢组的变化进行分析，并与无活性的发酵条件下的基因表达情况和代谢产物进行比较，即活性导向的比较转录组和比较代谢组分析，可以帮助我们找到活性相关的生物合成基因簇和代谢产物，并指导目标化合物的分离纯化与结构解析。

10、为了探明streptomyces sp.cpcc 200451中抗病毒活性的有效组分，我们以streptomyces sp.cpcc200451的全基因组信息作为研究的出发点，通过基因组生物信息学的分析，寻找次级代谢相关基因簇；利用活性导向的比较转录组数据分析，锁定cpcc200451活性相关物质的生物合成基因簇；结合分子生物学等技术手段，对目标基因簇的关键基因进行敲除和过表达等遗传操作，从而确定cpcc 200451活性组分所在的生物合成基因簇。并且，通过进行活性导向的比较代谢组数据分析，获得活性物质相关的结构特点，以帮助目标产物分离及结构确证。综合运用生物信息学与化学分离等技术方法，分离获得活性物质单体，最终明确了streptomyces sp.cpcc 200451抗病毒活性的药效成分。目前我们发现的streptomyces sp.cpcc 200451产生的抗病毒活性化合物中有些为已知的蛋白酶抑制剂，如antipain和chymostatin等，说明奥米克欣系列化合物可以靶向病毒和宿主细胞的蛋白酶，这可能是其具有针对多种呼吸道相关病毒尤其是冠状病毒和流感病毒的抗病毒活性的原因。[参考文献]

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技术实现思路

1、本发明首先涉及一组肽类化合物(奥米克欣)在制备抗病毒的药物中的应用，所述的肽类化合物的结构为式(1)所示：

2、

3、其中，r1～r5可选的各种取代基种类如下表所示：

4、

5、

6、优选的，所述的病毒为呼吸道病毒；

7、最优选的，所述的病毒为流感病毒、冠状病毒。

8、本发明还涉及所述的肽类化合物(奥米克欣)的制备方法，所述方法包括如下步骤，

9、(1)发酵链霉菌(streptomyces sp.)cpcc 200451，发酵液离心(4000rpm/min，15min)后收取上清液；

10、(2)采用大孔吸附树脂级联反相c18层析柱hplc法收集活性组分；

11、(3)将步骤(2)获得的活性组分，经半制备rp-hplc分离，即得所述肽类化合物奥米克欣。

12、步骤(1)所述的发酵为，

13、以10％的接种量转种于a3发酵培养基中，在28℃、200rpm下培养3～10d后，收集发酵液；

14、所述a3发酵培养基各成分含量为(单位为g/l)：甘油20，糊精20，蛋白胨10，酵母粉5，硫酸铵2，碳酸钙2；ph 7.2-7.4；

15、步骤(2)的大孔吸附树脂级联反相hplc法的步骤参数为：

16、使用hp20大孔吸附树脂和c18反相hplc层析柱，

17、分离步骤为：

18、1)上清液经大孔吸附树脂diaion hp20进行吸附后，使用两倍柱体积的去离子水冲洗；

19、2)采用乙醇-水进行梯度洗脱(20％、50％和100％乙醇依次洗脱)，每个梯度洗脱至流出液无颜色或颜色不变，收集50％乙醇梯度的洗脱液，经过减压浓缩后备用；

20、3)步骤2)得到的50％乙醇梯度的洗脱液浓缩后进行c18柱层析，以乙腈-水梯度洗脱(10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、80％和100％乙腈)，收集15％～80％的梯度洗脱液，优选的，收集15％～20％乙腈-水洗脱液；

21、步骤(3)所述的半制备rp-hplc参数及方法为：色谱柱：shiseido capcell-pakpfp 5μm，10×250mm；流动相：

22、奥米克欣a系列化合物：25％ acn/含0.1％ tfa的h2o；

23、奥米克欣b系列化合物：20％ acn/含0.1％ hcooh的h2o；

24、奥米克欣c系列化合物：40％ acn/含0.1％ tfa的h2o；

25、流速：1.5ml/min。

26、本发明还涉及一组新的肽类化合物(奥米克欣)，所述肽类化合物分别为奥米克欣a1、a2、a6、b1、b2、b3、b5、b6、c1、c2、c6，其结构通式为式(1)所示，各个化合物的r1～r4的取代基分别如下表所示：

27、

28、

29、本发明还涉及微生物生物合成所述肽类化合物的基因簇，

30、所述的基因簇为链霉菌(streptomyces sp.)cpcc 200451基因组chromosome 1:7,822,964-7,875,615，全长为52.6kb；

31、优选的，该基因簇为基因7092-7102(chromosome 1:7,841,516-7,857,514)，全长15.99kb。

32、其中，基因7094、7098为奥米克欣的关键生物合成基因，其编码蛋白的氨基酸序列分别如seq id no.1、2所示，7102为奥米克欣生物合成基因簇的正调控基因，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

33、本发明还涉及提高所述奥米克欣基因簇表达水平的调节蛋白7102，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，其表达量与链霉菌(streptomyces sp.)cpcc 200451发酵液中奥米克欣的含量成正比。

34、本发明还涉及微生物生物合成所述肽类化合物(奥米克欣)的关键合成基因，所述的合成基因为7094、7098基因其编码蛋白的氨基酸序列分别如seq id no.1、2所示。

35、本发明还涉及所述的基因簇或调节基因在通过微生物发酵制备式(1)所述肽类化合物(奥米克欣)中的应用。