一种产β-胡萝卜素工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种产β-胡萝卜素工程菌及其应用，属于生物。

背景技术：

1、β-胡萝卜素是一种自然界中普遍存在的脂溶性色素，属于萜类化合物类胡萝卜素家族中的一员，其分子式为c40h56，分子量为536.88。除了具有出色的着色能力，β-胡萝卜素还是维生素a的前体物质，同时具有抗氧化、增强免疫力、抗炎、抗肿瘤等多种生理功能，在食品、医药、化妆品、动物饲料行业应用广泛，并且随着对其研究的逐渐深入，β-胡萝卜素的市场需求也日益增大。

2、β-胡萝卜素主要通过化学合成、植物提取及微生物发酵等三种方式获得。化学合成法虽然已实现β-胡萝卜素的商业化生产，但面临工艺流程复杂、副产物多、能耗高、对环境不友好、与天然β-胡萝卜素顺反异构体比例存在差异等问题。天然β-胡萝卜素的生产方式包括植物提取法及微生物发酵法两种，其中植物提取法主要利用有机溶剂萃取、超临界萃取等方式从胡萝卜、枸杞、沙棘等植物中分离得到β-胡萝卜素，但这些植物材料中β-胡萝卜素含量低、成分复杂，提取成本高，容易受到地域和环境的影响；微生物发酵法主要利用能合成β-胡萝卜素的细菌、真菌等进行发酵培养并从中提取β-胡萝卜素，具有生产周期短、可连续生产、环境污染少、生物安全性高等优点。微生物β-胡萝卜素的发酵水平往往决定了其生产成本的高低及商业化应用的前景，目前常应用于β-胡萝卜素发酵的三孢布拉氏霉菌易发生退化、培养困难、发酵技术复杂，其它野生菌株及通过基因工程改造获得的大肠杆菌、酿酒酵母等工程菌的β-胡萝卜素发酵产量也有待提高。因此，获得优良菌株提高β-胡萝卜素产量是实现β-胡萝卜素高效发酵生产的关键。

技术实现思路

1、本发明采用基因工程方法，在解脂耶氏酵母mya-2613中表达解脂耶氏酵母ggs1基因、hmgr基因、多个拷贝(两个拷贝及以上)的卷枝毛霉β-胡萝卜素合成基因carb和多个拷贝(两个拷贝及以上)的卷枝毛霉β-胡萝卜素合成基因carrp，构建产β-胡萝卜素基因工程菌，然后在此基础上进行诱变育种，最终获得β-胡萝卜素高产菌株，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2021年11月8日，保藏编号为cgmcc no.23758。

2、因此，本发明的第一个目的是提供一种产β-胡萝卜素的工程菌cgmcc no.23758。本发明的另一目的是提供所述产β-胡萝卜素的工程菌cgmcc no.23758的应用。本发明的另一目的是提供利用所述工程菌发酵产β-胡萝卜素的方法。本发明的另一目的是提供基因工程菌及其构建方法和应用。

3、为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

4、作为本发明的第一个方面，一种产β-胡萝卜素的工程菌cgmcc no.23758，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2021年11月8日，保藏编号为cgmccno.23758。

5、根据本发明，所述产β-胡萝卜素的工程菌cgmcc no.23758，其是在解脂耶氏酵母mya-2613中表达解脂耶氏酵母ggs1基因、hmgr基因及三个拷贝的卷枝毛霉基因carb和carrp，再进行诱变育种获得。

6、根据本发明，所述产β-胡萝卜素的工程菌cgmcc no.23758，其在含发酵培养基的摇瓶中，28℃，220rpm振荡培养5天，产量为2.54g/l；所述发酵培养基的组成为：葡萄糖50g/l，蛋白胨15g/l，酵母粉20g/l，其余为水；所述β-胡萝卜素通过hplc方法测得；或，

7、所述产β-胡萝卜素的工程菌cgmcc no.23758，在含发酵培养基(葡萄糖40g/l，蛋白胨15g/l，酵母粉20g/l，磷酸二氢钾1g/l，其余为水)的发酵罐中，28℃，通气量1：1(vol：vol)，500rpm振荡培养160h，产量为8.56g/l；发酵过程中补加葡萄糖；所述β-胡萝卜素通过hplc方法测得。

8、所述hplc方法参照yoon sh,lee sh,das a,ryu hk,jang hj,kim jy,oh dk,keasling jd,kim sw.j biotechnol.2009,140(3-4):218-226。

9、作为本发明的另一个方面，一种如上所述的产β-胡萝卜素的工程菌cgmccno.23758用于发酵生产β-胡萝卜素的应用。

10、作为本发明的另一个方面，一种工程菌产β-胡萝卜素的方法，将所述工程菌cgmccno.23758接种于发酵培养基发酵生产β-胡萝卜素。所用发酵培养基的碳源选自葡萄糖、豆油、甘油、乙酸盐中的一种或几种，氮源选自酵母粉、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵中的一种或几种。

11、当采用摇瓶发酵培养时，所述发酵培养基包括碳源和氮源；所述碳源选自葡萄糖、豆油、甘油、乙酸盐中的一种或几种；所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵中的一种或几种。在一优选实施方式中，所述发酵培养基的组成成分为：葡萄糖10-90g/l，蛋白胨8-30g/l，酵母粉8-45g/l，其余为水。所述发酵的温度为20-37℃；在一优选实施方式中，所述发酵的温度为28℃。

12、当采用发酵罐培养时，所述发酵培养基包括碳源和氮源，所述碳源选自葡萄糖、豆油、甘油、乙酸盐中的一种或几种；所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵中的一种或几种。在一优选实施方式中，所述发酵培养基的组成成分为：葡萄糖30-70g/l，蛋白胨8-30g/l，酵母粉8-45g/l，磷酸二氢钾0.5-5g/l，其余为水。所述发酵的温度为20-37℃。在一优选实施方式中，所述发酵的温度为28℃。

13、作为本发明的另一个方面，一种用于产β-胡萝卜素的基因工程菌，其是在酵母染色体上形成多拷贝的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)合成酶基因ggs1、hmg-coa还原酶基因hmgr，多拷贝的来源于卷枝毛霉的β-胡萝卜素合成基因carb，多拷贝的来源于卷枝毛霉中的β-胡萝卜素合成基因carrp构建得到；

14、所述ggs1通过seq id no:37～38所示的引物以解脂耶氏酵母mya-2613染色体为模板扩增得到；所述hmgr为截短的hmgr，其通过seq id no:47～48所示的引物，以解脂耶氏酵母mya-2613染色体为模板扩增得到；所述carb的genebank登录号aj238028；所述carrp的genebank登录号aj250827。

15、作为本发明的另一个方面，如上所述的基因工程菌在发酵生产β-胡萝卜素或构建发酵高产β-胡萝卜素的菌株中的应用。

16、作为本发明的另一个方面，如上所述的基因工程菌的构建方法，所述方法包括：

17、(1)构建重组质粒pmd-h1brp，将基因carb、carrp和筛选标记leu构建在pmd19-tsimple载体上，得到所述重组质粒pmd-h1brp；

18、(2)构建重组质粒pmd-h2brpg，将基因carb、carrp、ggs1和可回收筛选标记hisg-ura3-hisg构建在pmd19-t simple载体上，得到所述重组质粒pmd-h2brpg；

19、(3)构建重组质粒pmd-h3hm，将基因hmgr和可回收筛选标记hisg-ura3-hisg构建在pmd19-t simple载体上，得到所述重组质粒pmd-h3hm；

20、(4)构建重组质粒pmd-h4brp，将基因carb、carrp和可回收筛选标记hisg-ura3-hisg构建在pmd19-t simple载体上，得到所述重组质粒pmd-h4brp；

21、(5)工程菌构建

22、将(1)构建的pmd-h1brp酶切线性化后，转入解脂耶氏酵母中进行筛选，获得突变株mc-brp；

23、将(2)构建的pmd-h2brpg酶切线性化后，转入所述mc-brp中，进行筛选，获得突变株mc-2brp-g；

24、筛选ura3缺陷的mc-2brp-g，得到mc-2brp-g-foa，将(3)构建的pmd-h3hm酶切线性化后，转入所述mc-2brp-g-foa中，进行筛选，获得突变株mc-2brp-gh；

25、筛选ura3缺陷的，得到mc-2brp-gh-foa，将(4)构建的pmd-h4brp酶切线性化后，转入所述mc-2brp-gh-foa中，进行筛选，获得突变株mc-3brp-gh，即得到所述基因工程菌。

26、相对于现有技术，本发明的有益效果包括：通过基因工程技术及随机诱变，获得解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)cgmcc no.23758，其能够过量表达ggpp合成酶基因ggs1、hmg-coa还原酶基因hmgr，以及能够将ggpp转化为β-胡萝卜素的卷枝毛霉中的β-胡萝卜素合成基因carb和carrp，在发酵160h后，β-胡萝卜素产量达到8.56g/l，是β-胡萝卜素高产的优良菌株。本发明提供调节微生物细胞中促进β-胡萝卜素合成的关键酶的表达，调控β-胡萝卜素合成途径，促进代谢流快速流向代谢产物，能够实现代谢产物过量积累，为采用代谢工程手段改造菌株、提高目的产物的生成提供新思路，具有广阔的工业应用前景。