用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的引物组、试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于微生物检测领域，具体涉及用于(prrsv)谱系1c变异株crispr检测的引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive respiratory syndromevirus，prrsv)是一种可以引起以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的猪繁殖与呼吸综合征的病毒，该病流行广，对养猪业危害严重。

2、prrsv属于单分子线状单股正链rna，全长约为15kb。prrsv分为两个基因型：欧洲型(基因i型)和北美型(基因ii型)。但由于prrsv病毒基因变异，导致对于新型变异株的检测方法不准确，且一般的检测方法无法区分出经典株和变异株，因此需要开发新的方法检测prrsv谱系变异株。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)谱系1c变异株crispr检测的引物组、试剂盒及其检测方法，能够高效、灵敏、特异性地检测prrsv谱系1c变异株。

2、根据本发明的一个方面，提出了用于prrsv谱系1c变异株crispr检测的引物组，包括：如seq id no.1和seq id no.2所示序列的核酸扩增引物对。

3、在本发明的一些实施方式中，所述的引物组还包括如seq id no.3和seq id no.4所示序列的crdna引物对。

4、在本发明的一些实施方式中，所述的prrsv谱系1c变异株含有两个prrsv谱系1c变异株序列的基因核苷酸，其中，一个为全基因序列，genbank登录号为mw887655.1；另一个为测序获得的长度为603bp的序列，基因序列为(5’-3’)：atgttggggaaatgcttgaccgcgggctgttgctcgcaattgctttttttgtggtgtatcgtgccgttctgttttgttgcgctcgtcaacgccaacaacagcagcagctcccatttacagttgatttataacctgacgatatgtgagctgaatggcacagattggctaaatgaaagatttgactgggcagtggagactttcgttatctttcctgtgttgactcatatcgtctcttacggtgcccttaccactagccattttcttgacacggtcggcttggccactgtgtccaccgccggatattatcacgggcggtatgtattgagtagcatttacgctgtctgtgccctggctgcgttgatttgcttcgccattaggttggcgaaaaattgcatgtcctggcgctactcatgcaccagatataccaattttctcctggatactaagggcaaactctaccgctggcggtcatccgtcattatagagaaagggggtaaagtggatgttgggggtcacttaatcgacctcaaaagagttgtgcttgatggttccgcggcaacccctgtaaccaagatttcagcggaacaatggggtcgtccatag。

5、根据本发明的另一个方面，提出了用于prrsv谱系1c变异株crispr检测的试剂盒，包括：上述引物组、核酸扩增试剂、crrna转录试剂和cas12a酶。

6、在本发明的一些实施方式中，所述核酸扩增试剂为rpa或raa扩增试剂。

7、在本发明的一些实施方式中，所述crrna转录试剂包括缓冲液、ntp、t7 rna聚合酶中的至少一种。

8、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括探针，所述探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。

9、在本发明的一些优选的实施方式中，所述探针的两端分别连接荧光基团，所述荧光基团选自fam、tamra、tet、hex、cy3、cy5和rox中的至少一种。

10、根据本发明的再一个方面，提出了用于prrsv谱系1c变异株crispr检测的检测方法，包括以下步骤：

11、s1、提取待检测样本的dna；

12、s2、使用上述核酸扩增引物组和核酸扩增试剂对步骤s1中获得的dna进行核酸扩增反应，得到核酸扩增产物；

13、s3、将crrna、探针和cas12a酶与步骤s2中得到的核酸扩增产物混合，对所述核酸扩增产物进行crispr/cas12a反应；

14、s4、通过荧光检测确定检测结果。

15、在本发明的一些实施方式中，所述的方法为非诊断性和非治疗性方法。

16、在本发明的一些实施方式中，步骤s3中所述crrna通过crrna转录试剂将上述所述crdna引物对转录为所述crrna。

17、在本发明的一些优选的实施方式中，所述将所述crdna序列转录为所述crrna，具体包括以下步骤：将所述crdna引物对的上下游序列退火形成双链；将用t7转录试剂盒转录双链得到的crrna纯化后即得到纯度较高crrna。

18、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中所述核酸扩增反应为重组酶介导等温核酸扩增反应，包括rpa扩增反应或raa扩增反应。

19、在本发明中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)和重组酶介导的扩增技术(recombinase-aidamplification，raa)均为常用的恒温扩增技术，在扩增过程中均使用重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶，在37℃恒温下进行核酸快速扩增。其不同点在于重组酶的来源不同，rpa体系的重组酶来源于t4噬菌体，raa体系的重组酶来源于细菌或者真菌。在本发明的一些实例中，均可购买商业化的rpa或raa体系的核酸扩增试剂进行反应。

20、在本发明的一些实施方式中，步骤s3中所述crispr/cas12a反应的反应温度约为39℃，所述crispr/cas12a反应的时间为30～40min。

21、在本发明中，crispr/cas12a作为一种新兴的生物技术，可以用于病原菌的快速恒温检测。casl2a能在crrna的引导下特异识别并裂解富含t核苷酸pam序列的dsdna，并在特定的位点裂解靶标链实现检测的目的。将rpa扩增技术与cas12a偶联，使用rpa扩增技术进行靶标dna扩增,再加入crispr体系，cas12a-crrna复合物结合靶标dna后，激活了反式切割活性，切割体系中的标记荧光基团，产生荧光信号。该方法的主要特点在于高效快速、操作简单、特异性强、灵敏度高，适用于实时现场检测。高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。

22、在本发明的一些具体的实施方式中，有益效果至少包括：本发明实施例设计的引物组具有极高的特异性及灵敏度，能够准确检测prrsv谱系1c变异株，且对prrsv的欧洲型和美洲型经典株及其它类别病毒检测呈阴性；本发明实施例的检测方法使用crispr/cas12a技术能在30～40min内完成高效率的基因扩增，crispr/cas12a扩增的灵敏度是普通raa扩增的100倍，检测限可达102cfu/ml，时间短、操作方便、灵敏度高、结果判断简单。