微生物转化生产二胺的方法

本发明属于生物催化，涉及微生物转化生产二胺的方法，具体地说，涉及一种大肠杆菌工程菌催化环烷烃/环烷醇/二醇反应生产α,ω-二胺的方法。

背景技术：

1、脂肪族α,ω-二胺(da)是大宗化学品，主要用作聚酰胺塑料制造中的单体前体，在工程塑料、机械配件、纤维、薄膜和其他应用的制造中具有广泛的应用，然而目前da的合成方法是对环境有害的能量密集型多步骤化学反应。例如1,6-己二胺(hmd)每年大约生产1.2mt，是尼龙66合成中最重要的单体之一，尼龙66是纺织和塑料行业重要的聚酰胺，2019年全球尼龙66市场规模估计为162.9亿美元，预计从2019年到2027年每年增长6.5％。hmd主要是通过丁二烯氢氰化在高技术控制下合成的，但其存在使用剧毒氰化氢、选择性不理想和反应复杂的缺陷。为了克服这些缺陷，多年来人们一直在尝试通过更换有害试剂或/和改变原材料基础来寻找更环保的工艺，已经开发了一些避免使用氰化物并从容易获得的材料(例如，1,6-己二醇)作为底物的方法，但仍然存在诸如高反应温度、高压和高催化剂负载等限制，因此迫切需要开发绿色、安全的da合成路线。

2、生物生产方法反应条件温和，且有优异的选择性。迄今为止，仅一种从己二酸(aa)到hmd的生物催化途径有文献报道，是通过羧酸还原酶(car)和转氨酶(ta)催化两轮还原/胺化反应，该方法仅产生约3mm hmd，而且70％积累了中间体副产物6-氨基己酸(6-aca)。此外，尽管一些专利提出了用于hmd生物合成的各种非天然生物途径，但均没有后续的研究开发报道。因此，非常需要一种用于高效合成hmd的新生物催化途径。

技术实现思路

1、本课题组经过数年的探索，开发了一种一锅法微生物体内生物催化级联反应，借助基因工程将环烷烃生物转化为da。该研究包括用于生物催化路线设计的retrobiocat工具优化和利用、用于寻找合适酶的酶挖掘和用于有效途径组装的微生物群落构建，开发的基于微生物联合催化系统成功生产出了da比如hmd等，当使用环己醇chol和环己烷ch作为底物时，产物da浓度分别高达16.5mm和7.6mm，取得了目前报道的最高hmd生物合成产量，为高效、绿色的da生产提供了一条有前景的途径。具体而言，本发明包括如下技术方案。

2、一种微生物转化生产二胺(或称α,ω-二胺，da)的方法，包括如下步骤：

3、以α,ω-二醇(do)为原料，用大肠杆菌工程菌模块3催化反应，得到α,ω-二胺；或者

4、以环烷醇为原料，用大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化，得到α,ω-二胺；或者

5、以环烷烃为原料，用大肠杆菌工程菌模块1、大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3进行“一锅法”联合催化，得到α,ω-二胺，其中

6、大肠杆菌工程菌模块3过表达醇脱氢酶chnd和转氨酶(ta)，简写为m3；

7、大肠杆菌工程菌模块2过表达醇脱氢酶adh、baeyer-villiger单加氧酶(bvmo)、内酯酶(lac)、羧酸还原酶(car)、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(sfp)，并且表达内源性醛酮还原酶(akr)，简写为m2；

8、大肠杆菌工程菌模块1过表达p450酶，简写为m1。

9、上述α,ω-二胺可以是c6-c8的α,ω-二胺即1,6-己二胺、1,7-庚二胺或者1,8-辛二胺；相应地，所述环烷醇为环己醇、环庚醇或者环辛醇；所述环烷烃为环己烷、环庚烷或者环辛烷。

10、优选地，所述α,ω-二胺是1,6-己二胺(hmd)，所述环烷醇为环己醇(chol)，所述环烷烃为环己烷(ch)。

11、在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块3中过表达的所述醇脱氢酶chnd编码基因序列为seq id no:1；所述转氨酶(ta)选自下组中的一种：cv，编码基因序列为seqid no:2，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3a；pp2159，编码基因序列为seq id no:3，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3b；sav2614，编码基因序列为seq id no:4，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3c；pak，编码基因序列为seq id no:5，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3d；或者spo3471，编码基因序列为seq id no:6，对应的大肠杆菌工程菌模块3简称为m3e。

12、在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块2中过表达的所述醇脱氢酶adh编码基因序列为seq id no:7；所述baeyer-villiger单加氧酶(bvmo)编码基因序列为seq idno:8；所述内酯酶(lac)编码基因序列为seq id no:9；所述羧酸还原酶(car)编码基因序列为seq id no:10；所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(sfp)编码基因序列为seq id no:11。

13、由于醛酮还原酶(akr)是大肠杆菌内源性的，无需进行过表达。

14、在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块1中过表达的所述p450酶是在专利文献cn111411128a和文献yu hl,et al.,bioamination of alkane with ammonium by anartificially designed multienzyme cascade.metabolic engineering.47,184-189(2018).中报道的p450bm319a12，编码基因序列为seq id no:12；或者是专利文献cn114836486a中报道的野生型细胞色素p450-bm3 wt(来源于巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、细胞色素突变体p450-bm3 f87g或者细胞色素p450pyrtm(来源于鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.hxn-200))、或者是salamanca,diego,et al."novel cyclohexanemonooxygenase from acidovorax sp.chx100."applied microbiology andbiotechnology.99 6889-6897(2015).中报道的细胞色素p450chx。

15、上述大肠杆菌工程菌模块3可以通过下述方法构建得到：将chnd基因和一种ta基因(选自cv、pp2159、sav2614、pak和spo3471)克隆到质粒petduet-1上，构建的质粒petduet-chnd-ta依次包含t7启动子、chnd基因、rbs位点和ta基因，命名为petduet-chnd-ta；然后将构建的质粒petduet-chnd-ta转化到大肠杆菌中，得到大肠杆菌工程菌。

16、在一种实施方式中，上述大肠杆菌工程菌模块2可以通过下述方法构建得到：

17、1)将adh基因、car基因、sfp基因和bvmo基因克隆到质粒prsfduet-1上，构建的质粒(prsfduet-car，sfp，bvmo，adh)包含t7启动子、两个基因之间的rbs位点，命名为(prsfduet-car，sfp，bvmo，adh)；

18、2)将lac基因在ldha位点整合到大肠杆菌基因组中，得到大肠杆菌工程菌；

19、3)将构建的质粒(prsfduet-car，sfp，bvmo，adh)转化到基因组中整合了lac基因的大肠杆菌工程菌中。

20、根据质粒rsf中t7启动子下游各基因的顺序排列，大肠杆菌工程菌模块2分别命名如下：

21、t7启动子-adh-car-sfp-bvmo(大肠杆菌基因组中整合了lac基因)，命名为m2a；

22、t7启动子-adh-bvmo-car-sfp(大肠杆菌基因组中整合了lac基因)，命名为m2b；

23、t7启动子-bvmo-adh-car-sfp(大肠杆菌基因组中整合了lac基因)，命名为m2c；

24、t7启动子-car-sfp-bvmo-adh(大肠杆菌基因组中整合了lac基因)，命名为m2d；

25、t7启动子-car-sfp-adh-bvmo(大肠杆菌基因组中整合了lac基因)，命名为m2e；t7启动子-car-linker-sfp-adh-bvmo(大肠杆菌基因组中整合了lac基因)，命名为m2f，即sfp与car融合形成融合蛋白(进一步增强car的催化活性)。

26、其中连接car基因和sfp基因的接头(linker)可以是碱基序列ggcggcggaggctctggcggacccggctct。

27、上述大肠杆菌工程菌模块1可以通过下述方法构建得到：将p450酶基因克隆到表达载体prsf-duet(购自novagen)上相应位点，酶切位点为ndei和bamhi，将p450酶基因的表达置于t7启动子和laci阻遏基因的控制下，获得重组质粒prsf-duet-p450；将质粒prsf-duet-p450转化到大肠杆菌中，得到表达p450酶的大肠杆菌工程菌。

28、上述方法中，当以环烷醇为原料，用大肠杆菌工程菌模块2和模块3进行“一锅法”联合催化时，采用一锅两步法的生物催化级联反应、或者一锅一步法，其中，

29、一锅两步法是使用细胞模块2将底物环烷醇转化为α,ω-二醇(do)，底物环烷醇完全转化后，将细胞模块3添加反应体系中，并添加l-ala或异丙胺作为氨供体(优选使用异丙胺作为氨供体)，进行α,ω-二醇(do)到α,ω-二胺(da)的反应；

30、一锅一步法是将细胞模块2和3组合起来形成大肠杆菌菌群2_3(ec2_3)，在一个体系中同时催化反应，并添加l-ala或异丙胺作为氨供体，优选使用异丙胺作为氨供体；

31、优选地，大肠杆菌菌群2_3(ec2_3)是大肠杆菌细胞模块(m2d)与大肠杆菌细胞模块(m3a)的组合。

32、当以环烷烃(例如ch)为原料，用大肠杆菌工程菌模块1、大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3组成大肠杆菌菌群1_2_3(ec1_2_3)进行“一锅法”联合催化时，采用一锅两步法进行：第一步由细胞模块1和2的组合催化环烷烃(例如ch)转化为环烷醇(例如chol)进而转化为α,ω-二醇(do)，第二步反应添加细胞模块3以催化α,ω-二醇(do)转化为α,ω-二胺(da)。

33、优选地，大肠杆菌菌群1_2_3(ec1_2_3)中的大肠杆菌工程菌模块2和大肠杆菌工程菌模块3组合是大肠杆菌(m2d)与大肠杆菌(m3d)的组合。

34、本发明开辟了一种全过程绿色环保的α,ω-二胺生产工艺，不仅克服了化学合成法或者半化学合成+半生物催化的诸多缺陷，还避免了多步骤酶催化反应必须提供多品种昂贵酶、辅酶或辅因子导致高经济成本的缺陷，而且微生物可以通过发酵而源源不断地提供，是取之不竭的生物反应器体系，有助于大大降低α,ω-二胺生产成本。本发明开发的微生物组催化系统在生产hmd时，使用环己醇和环己烷作为底物，产物浓度分别高达16.5mm和7.6mm，是目前最高的hmd生物合成的产量，为高效、绿色的da生产提供了一条有前景的途径。