一种用于预防慢性疲劳综合征的长柄扁桃酶解肽及其应用

1.本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种来源于长柄扁桃种仁蛋白的可预防慢性疲劳综合征的多肽。
2.背景领域
3.疲劳是一种常见症状，正常的疲劳，通常发生在剧烈的体力劳动之后，往往是一种保护性的信号，提示身体应该休息，可以通过休息或改变生活方式来缓解。与正常疲劳相比，病理性疲劳并不随休息而改善，许多慢性疾病患者都有这种经历。它的强度更大，持续时间更长，会对个体的功能活动和生活质量造成严重损害。但人们在生活中忽视了疲劳的影响，往往误解为嗜睡甚至是懒惰，因此不去寻找专业地医疗治疗，从而进一步加速了疲劳的负面影响。此外，经常性或不易恢复的疲劳状态可能是潜在病理以及慢性疾病的表象，如慢性肾病、阻塞性肺炎、心力衰竭、多发性硬化以及癌症等。
4.随着人们对健康的日益关注和饮食安全的愈发重要，植物来源的抗疲劳肽以其高效、安全的独特优势在预防人类亚健康方面起着极其重要的作用，与化学合成药物相比，植物来源的抗疲劳肽不仅能够有效的预防机体疲劳的产生，且更具有毒副作用低的天然优势。长柄扁桃是蔷薇科桃属扁桃亚属的一种多年生落叶灌木，又称野樱桃。长柄扁桃具有很强的耐寒和耐旱能力，根系深，可以适应各种土壤环境。对于长柄扁桃种仁中蛋白质资源的开发正在逐步发展，其中含有三百余种蛋白质，其氨基酸种类齐全，且具有抗氧化、抗疲劳和提高身体免疫力等多种生物活性，是生物活性肽的优质来源，对长柄扁桃酶解肽抗疲劳肽的研究与开发能够进一步拓宽其应用范围，有助于延伸长柄扁桃产业链，为我国长柄扁桃的产业开发和利用提供研究依据。


技术实现要素：

5.本发明以长柄扁桃种仁为原料，对长柄扁桃种仁进行脱壳预处理后，用正己烷进行脱脂，选用水提法制备长柄扁桃蛋白并用碱性蛋白酶酶解成长柄扁桃酶解肽，通过小鼠抗疲劳实验评价了长柄扁桃酶解肽的抗疲劳活性，并将长柄扁桃酶解肽进一步分离纯化并用液相色谱-质谱联用技术(lc-ms/ms)鉴定长柄扁桃酶解肽的序列，利用分子对接技术筛选出最具有抗疲劳活性的多肽片段。
6.本发明提供的预防慢性疲劳综合征的长柄扁桃酶解肽，其自n端到c端的氨基酸序列为：glu-val-glu-arg-leu-phe，以下简称为everlf。
7.本发明长柄扁桃酶解肽可用于制备预防慢性疲劳综合征的药物。在使用该长柄扁桃酶解肽时，可通过人工合成或长柄扁桃种仁蛋白酶解后分离纯化获得。
8.本发明的有益效果如下：
9.本发明以长柄扁桃种仁为原料，采用碱性蛋白酶对长柄扁桃蛋白进行酶解，得到长柄扁桃酶解肽。用小鼠抗疲劳实验研究长柄扁桃酶解肽的抗疲劳活性，将长柄扁桃酶解肽分离纯化后用lc-ms/ms测定其多肽序列，并用分子对接技术筛选出最具有预防慢性疲劳综合征的肽片段。本发明制备长柄扁桃酶解肽，不仅步骤简单而且成本低廉，为进一步拓宽
长柄扁桃酶解肽的应用范围提供基础依据，
附图说明
10.图1是长柄扁桃酶解肽对小鼠力竭游泳时间的影响。
11.图2是长柄扁桃酶解肽的纯化色谱图。
12.图3是长柄扁桃酶解肽不同组分的dpph自由基清除活性。
具体实施方式
13.下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
14.实施例1
15.1.长柄扁桃蛋白的制备
16.长柄扁桃种仁经热烫后，采用手工去皮，于40℃烘干，用高速粉碎机粉碎，得到长柄扁桃种仁粉。以1:5(g/ml)的料液比，将长柄扁桃种仁粉加入正己烷中，通风橱内搅拌40分钟进行脱脂，倒掉正己烷；再重复脱脂3次，抽滤掉正己烷，将得到的长柄扁桃脱脂种仁粉于25℃干燥。将干燥的长柄扁桃脱脂种仁粉和蒸馏水以1:16 (g/ml)的料液比进行混合，在室温条件下搅拌90分钟，随后4000转/分钟离心10 分钟，收集上清液过滤，冷冻干燥后得到长柄扁桃蛋白，放置在-20℃的冰箱中保存备用。
17.2.长柄扁桃酶解肽的制备
18.按照料液比为1g:25ml，将长柄扁桃蛋白粉溶解于蒸馏水，在90℃下预处理10 分钟，调节温度为57℃并用0.5m naoh水溶液调节ph为8.4，用碱性蛋白酶进行酶解，加酶量为1192u/g，水浴水解4小时，水解过程中用0.5m naoh水溶液维持溶液ph为8.4。水解结束后100℃水浴10分钟灭酶，8000转/分钟离心10分钟，取上清液，冷冻干燥成粉末，得到长柄扁桃酶解肽(aph)，放于-20℃冰箱保存备用。
19.3.长柄扁桃酶解肽抗疲劳活性的测定
20.昆明种小鼠30只，雄性，按体重随机分为五组，分别为对照组(con)、西洋参阳性对照组(ags)、长柄扁桃酶解肽高、中、低剂量组(aph-h、aph-m、aph-l)，对照组给与生理盐水，阳性对照组给与西洋参0.6mg/g；长柄扁桃酶解肽高、中、低剂量组分别每天给药剂量为2mg/g、1mg/g和0.5mg/g，给药频率为1次/天，共给药 28天，给药结束后测定力竭游泳时间。如图1所示，与con组小鼠相比，ags、aph-m 和aph-h组小鼠的力竭游泳时间均显著增加(p《0.05)，且呈现剂量依赖关系，ags、 aph-l、aph-m和aph-h组小鼠力竭游泳时长分别提升到了1.68、1.23、1.37和1.59 倍，表明长柄扁桃酶解肽给药后显著提高了小鼠运动耐力。长柄扁桃酶解肽可以显著增加小鼠的力竭游泳时间，说明长柄扁桃酶解肽具有缓解小鼠疲劳的功效。
21.4.长柄扁桃酶解肽的分离纯化和鉴定
22.用c18色谱柱对长柄扁桃酶解肽进行分离纯化，流动相a为0.1％的三氟乙酸水溶液，b为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，先用5％b相平衡色谱柱，再进行梯度洗脱，洗脱程序为5％～90％b 40min，洗脱过程中分段收集样品。长柄扁桃酶解肽经过c18 色谱柱纯化后一共收集到五个组分(f1-f5)，冷冻干燥后测量五个组分的dpph清除活性，结果如图2、3所示，f4组
分具有较好的dpph自由基清除活性。将f4组分用nano lc-ms/ms鉴定其多肽序列，共鉴定筛选出5个关键抗疲劳多肽 fldvlr、fldlvr、everlf、efldrl、eflr，其自n端到c端的氨基酸序列如表1所示。
23.表1 5个关键抗疲劳多肽的氨基酸序列
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5.分子对接
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采用分子对接方法预测5个关键抗疲劳多肽与抗疲劳靶点之间的结合亲和力，以筛选最优抗疲劳多肽，为进一步的实验提供参考。vina评分越低，配体和受体之间的亲和力越高，一般选择阈值为affinity≤-5kcal/mol，低于该数值，则认为具有潜在亲和力。亲和力最低的构象被用作最佳对接构象，采用分子虚拟对接的方式分别对五个关键抗疲劳多肽与dlg4靶点进行了亲和力与结合模式的分析，并选取了共晶分子 glutathione(pubchem cid：124886)作为阳性对照分子，以筛选亲和力优于阳性对照分子的活性多肽。通过表2中的数据可以发现，对于dlg4靶点，fldvlr(affinity ＝-5.1kcal/mol)、everlf(affinity＝-5.9kcal/mol)和eflr(affinity＝-5.2kcal/mol) 亲和力打分均优于阳性对照分子glutathione(affinity＝-4.6kcal/mol)，其中everlf 的得分最低，能够与dlg4靶点形成比阳性对照分子更为稳定的结合模式，抗疲劳活性最优。
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表2 5个关键抗疲劳多肽与dlg4靶点的对接结果
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