核桃乙酰胆碱酯酶抑制肽及其应用

1.本发明属于核桃蛋白深加工领域，具体涉及核桃乙酰胆碱酯酶抑制肽及其应用。


背景技术：

2.阿尔兹海默症(alzheimer disease，ad)是老年痴呆的一个代表性病变，是老年人群中常见的神经退行性疾病和痴呆类型。其主要表现为记忆丧失，语言障碍，行为能力下降和认知能力丧失。ad的病因复杂多样，已被提出的机制包括有胆碱能假说、β淀粉样蛋白(aβ)病变假说、tau蛋白假说、氧化应激假说以及神经免疫炎症假说。目前，世界上较为普遍接受的ad病理机制为“胆碱能假说”。胆碱能假说认为大脑内乙酰胆碱(acetylcholine，ach)的缺失是导致疾病的关键因素，会造成ad患者认知功能下降和记忆能力丧失。因此，目前医学上多采用乙酰胆碱酯酶抑制剂(inhibitor of acetylcholinesterase，achei)来调节及控制ache的活性，减少其对脑内ach的水解，进而提高患者机体内神经系统受体处的ach水平，从而达到治疗或缓解ad症状的效果。
3.目前，经fda批准用于治疗ad的药物中,他克林(tacrine)、利斯的明(rivastigmine)、多奈哌齐(donepezil)和加兰他敏(galantamine)均属于achei。这些药物虽然有效，但大多数为合成药物，依然存在耐药性且具有一定的毒副作用，例如恶心或呕吐，肝毒性，消化不良，肌痛和厌食性头晕等。因此，寻找天然的选择性achei比化学合成的achei更可取，且临床验证结果提示：早期介入预防及治疗是防治ad的重要环节，因此，从食源性天然动植物资源中开发低成本、安全性高的achei用于阿尔兹海默症的预防和改善变得尤为重要。
4.核桃(walnut)是世界著名的“四大坚果”之一，具有丰富的营养价值和药用功效。研究者发现核桃具有大脑所需的蛋白质、脂肪酸、维生素、矿物质、多酚类化合物等营养物质，可提升认知能力。核桃榨油后产生大量的副产物核桃粕，多作为饲料、肥料出售，附加值较低，造成资源严重浪费，也严重阻碍了核桃产业的发展。研究发现通过酶解核桃蛋白制备的核桃多肽具有抗氧化、降血压、降尿酸以及改善记忆等功效，因此，从核桃粕中筛选乙酰胆碱酯酶抑制肽可以用于制备防治阿尔茨海默病的药物和辅助改善记忆功能的保健食品。
5.申请号为202111019074.6，名称为“一种核桃粕乙酰胆碱酯酶抑制肽及其制备方法与应用”的中国专利公开了以核桃粕为主要原料开发生物活性肽的制备方法，通过采用限制性酶解、超滤、葡聚糖凝胶层析分离纯化、lc-ms/ms及分子对接技术获得乙酰胆碱酯酶抑制肽，并通过体外乙酰胆碱酯酶活性鉴定表明其具有明显的乙酰胆碱酯酶抑制作用。但该法工艺复杂，需要多步分离纯化，且需要进一步乳液包埋体系构建，难于实现大规模生产。
6.申请号为202110045281.2，名称为“一种乙酰胆碱酯酶抑制肽及其应用”的中国专利公开了以核桃蛋白为主要原料开发生物活性肽的制备方法，通过采用虚拟酶解、水溶性和毒性预测及分子对接技术获得乙酰胆碱酯酶抑制肽，并通过体外乙酰胆碱酯酶活性鉴定表明其具有明显的乙酰胆碱酯酶抑制作用。但该法较为片面，缺少实际验证，和实际酶解存
在差异，需进一步优化。同时，本发明所公开的三条乙酰胆碱酯酶抑制肽活性均优于该发明所公开的多肽活性。
7.综上所述，优质的核桃蛋白多肽在实际生产中仍遇到诸多难题，其中对于成本高、时间长或缺少功效验证的难题，目前未见有效的处理方法。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供核桃乙酰胆碱酯酶抑制肽，为以下二肽的至少一种，分别是phe-arg，简称fr；ser-phe，简称sf；leu-arg，简称lf，其乙酰胆碱酯酶抑制活性ic50值分别是：134.71μmol/l、161.09μmol/l和203.91μmol/l。
9.本发明的另一目的在于，提供一种核桃蛋白酶解产物的制备方法。
10.本发明的再一目的在于提供上述的核桃乙酰胆碱酯酶抑制肽在食品、保健品或药品中的应用。
11.上述ache抑制活性肽序列，包括以所述ache抑制活性肽序列为核心，任何对其进行的相应的调整或修饰。
12.本发明的目的通过下述技术方案实现：
13.核桃乙酰胆碱酯酶抑制肽，为以下二肽的至少一种：
14.fr，其氨基酸序列为phe-arg；
15.sf，其氨基酸序列为ser-phe；
16.lf，其氨基酸序列为leu-arg。
17.所述的核桃乙酰胆碱酯酶抑制肽，能够结合乙酰胆碱酯酶，具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。
18.所述的核桃乙酰胆碱酯酶抑制肽为通过固相合成法或通过核桃蛋白酶解得到。
19.上述核桃乙酰胆碱酯酶抑制肽在制备食品、保健品或药品中的应用。
20.一种核桃蛋白酶解产物的制备方法，包括如下步骤：
21.(1)将核桃脱壳、脱脂、干燥并粉碎后得到核桃粕粉；
22.(2)核桃粕粉加水混匀，调节ph后搅拌，离心，取上清液；
23.(3)将上清液调节ph后搅拌，离心取沉淀；
24.(4)沉淀重新溶解后调节ph，透析，干燥得到核桃蛋白冻干粉；
25.(5)将核桃蛋白冻干粉用水重新溶解，调节ph，加入酶进行酶解，酶解结束后加热灭酶，离心取上清液，即得到含有核桃乙酰胆碱酯酶抑制肽的核桃蛋白酶解产物。
26.步骤(1)所述的脱脂为50～70℃冷榨脱脂。
27.步骤(1)所述的干燥为40～50℃低温烘干。
28.步骤(1)所述的核桃粕粉为过40～50目筛的核桃粕粉。
29.步骤(2)所述的水与核桃粕粉的料液比为8～16:1(v/w)；优选为12:1。
30.步骤(2)所述的调节ph为调节到8～9；优选为调节到8.5。
31.步骤(2)(3)所述的搅拌的条件为搅拌1～3h；优选为搅拌2h。
32.步骤(2)(3)所述的离心的条件为6000～10000r/min下离心10～30min；优选为8000r/min下离心20min。
33.步骤(3)所述的调节ph为调节至4～5；优选为调节至4.5。
34.步骤(4)所述的调节ph为调节至6～8；优选为调节至7.0。
35.步骤(4)所述的透析为使用35000～45000da透析袋透析36～64h；优选为使用40000da透析袋透析48h。
36.步骤(4)所述的干燥为真空冷冻干燥。
37.步骤(5)所述的水与核桃蛋白冻干粉的料液比为6～10:1(v/w)；优选为8:1。
38.步骤(5)所述的调节ph为调节至6～8；优选为调节至7.0。
39.步骤(5)所述的酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的至少一种；优选为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶。
40.步骤(5)所述的离心的条件为6000～10000r/min下离心10～30min；优选为8000r/min下离心15min。
41.所述的碱性蛋白酶的加入量为0.7～1.5％(w/w)；优选为0.75％。
42.所述的木瓜蛋白酶的加入量为0.3～0.4％(w/w)；优选为0.35％。
43.所述的碱性蛋白酶为alcalase 2.4l。
44.步骤(5)所述的酶解的条件是45～65℃下酶解5～25h；优选为56℃下酶解21h。
45.步骤(5)所述的加热灭酶为90～95℃水浴保温30～40min；优选为90℃水浴保温30min。
46.一种乙酰胆碱酯酶抑制肽的筛选方法，具体步骤如下：
47.采用uplc-esi-q-tof-ms/ms鉴定出核桃蛋白酶解液多肽序列，通过uniprot蛋白质数据库匹配，随后进行peptide ranker评分及分子对接vina评分，针对打分较高的多肽进行人工合成并验证其乙酰胆碱酯酶抑制活性，最后，再次利用分子对接技术将活性多肽与乙酰胆碱酯酶进行分子对接，分析其相互作用的关键氨基酸及作用力。
48.所述peptide ranker评分为0.5～1；
49.所述vina评分为-10～3kcal/mol；
50.上述活性肽中，fr对乙酰胆碱酯酶的的半抑制浓度(ic50)达到134.71μmol/l；sf对乙酰胆碱酯酶的的半抑制浓度(ic50)达到161.09μmol/l；lr对乙酰胆碱酯酶的的半抑制浓度(ic50)达到203.91μmol/l。同时明确了上述活性肽与乙酰胆碱酯酶结合的作用位点主要为疏水相互作用和氢键。
51.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
52.本发明所述乙酰胆碱酯酶抑制活性肽fr、sf、lr结构清晰明了，可通过现有技术固相化学合成方法获得。
53.本发明通过限制性酶解结合质谱和计算机模拟方法(uniprot蛋白质数据库匹配、peptide ranker及分子对接)筛选出高乙酰胆碱酯酶活性多肽，不仅可以降低人工成本，减轻工作强度，缩短开发周期，而且可以大大提高目标生物活性肽的制备成功率。
54.本发明的乙酰胆碱酯酶抑制活性肽具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，具有潜在的改善记忆的功效，既能够单独用于制备改善记忆药物或改善记忆保健品，也能够与现有技术的改善记忆相关物质复配使用，以便取得更好的协同改善记忆的效果。
附图说明
55.图1为实施例1和对比例1～2的酶解效率和乙酰胆碱酯酶抑制率图。
56.图2为乙酰胆碱酯酶抑制肽fr、sf、lr的乙酰胆碱酯酶抑制活性图。
57.图3为分子对接结果显示乙酰胆碱酯酶抑制肽fr、sf、lr与乙酰胆碱酯酶的相互作用图；其中a：fr；b：sf；c：lr。
58.图4为三种二肽的结构信息图；其中a：fr；b：sf；c：lr。
具体实施方式
59.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
60.下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
61.本领域技术人员在使用本发明提供的乙酰胆碱酯酶抑制肽时，可通过现有技术固相化学合成方法获得。
62.本发明中，乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定方法如下：
63.本发明所使用的5,5'-二硫双硝基苯甲酸(dtnb)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，碘代硫代乙酰胆碱(ach)及来自电鳗的乙酰胆碱酯酶(ache)均购自美国sigma公司；其他试剂无特殊说明均为国产分析纯。
64.将30μl ach(7.5mm)、125μl dtnb(5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)，3mm)、40μl hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，ph 8.0，50mm，含有0.1％牛血清蛋白)以及50μl样品分别加入96孔板中，混匀后在37℃下孵育15min。孵育结束后加入30μl ache(0.055u/ml)开始测定。测定过程在酶标仪中进行。测定波长为412nm，测定时间为15min。同时设立空白对照组。按下式计算酶活性抑制率。
65.乙酰胆碱酯酶抑制活性(％)＝[1-(a样品-a样品空白)/(a对照-a对照空白)]
×
100％
[0066]
其中，a样品为样品组吸光值，a样品空白为不加酶样品组吸光值，a对照为加酶不加样品组吸光值，a对照空白为不加酶不加样品组吸光值。
[0067]
实施例1一种核桃粕多肽的制备方法
[0068]
(1)将核桃(金品成食品旗舰店-新疆薄皮核桃)去壳得到核仁，用榨油机在60℃下冷榨脱脂得到核桃粕，40℃低温烘干，粉碎后过40目筛获取透过物料，得到核桃粕粉。
[0069]
(2)以液料比12:1(v/w，其中体积单位为l，质量单位为kg，下同)，加入去离子水和核桃粕粉，搅拌均匀后用0.1m naoh和0.1m hcl调节ph至8.5，继续匀速搅拌2h，在8000r/min条件下离心20min得到上清液并使用用0.1mnaoh和0.1m hcl调节ph至其等电点4.5，继续匀速搅拌2h，在8000r/min条件下离心20min，取下层沉淀物，加水充分溶解后，用0.1m naoh和0.1m hcl调节ph至7.0，采用40000da透析袋透析48h后，将其真空冷冻干燥后得到核桃蛋白冻干粉，于-20℃保存。
[0070]
(3)以液料比为8:1(v/w)加去离子水和步骤(1)制备得到的核桃蛋白冻干粉，用0.1mol/l naoh调节ph至7.0，酶解温度调至56℃，添加0.75％(w/w)alcalase 2.4l和0.35％(w/w)木瓜蛋白酶后水解核桃蛋白溶液21h。酶解结束后将酶解液于90℃水浴保温30min灭酶，终止反应。冷却后于8000r/min条件下离心15min，取上清液，得到核桃蛋白酶解
产物1，并将其在-20℃冷冻保存。
[0071]
制备完成后，测定酶解产物的蛋白回收率和水解度，具体方法如下。
[0072]
a.蛋白回收率(pr)的测定
[0073]
采用凯氏定氮法分别测定核桃蛋白酶解产物上清液中的蛋白含量以及核桃蛋白原料中蛋白含量，酶解产物的蛋白回收率计算公式如下：
[0074][0075]
式中，x1指核桃蛋白酶解产物上清液中蛋白含量，％；m1指核桃蛋白酶解产物上清液质量，g；x2指核桃蛋白原料中蛋白含量，％；m2指核桃蛋白原料质量，g。
[0076]
b.游离氨基态氮(an)含量的测定
[0077]
采用甲醛电位滴定法测定核桃蛋白酶解产物上清液中游离氨态氮含量。核桃蛋白酶解产物上清液中游离氨态氮的含量按如下公式计算：
[0078][0079]
式中，v1、v0分别指样液和空白加入甲醛后ph从8.2滴定至9.2所消耗的naoh标准溶液的体积，ml；mi指测定样品中游离氨基酸时的取样量，g。
[0080]
c.水解度(dh)的测定
[0081][0082]
an指上一步中测得的样品中的游离氨基酸态氮的含量，％；m1指核桃蛋白酶解产物上清液质量，g；w2指核桃蛋白的氮含量，％；m2指核桃蛋白原料质量，g。
[0083]
结果：核桃蛋白酶解产物1的蛋白回收率、水解度、乙酰胆碱酯酶抑制率(蛋白浓度为10mg/ml)如图1所示。
[0084]
对比例1
[0085]
(1)以液料比12:1(v/w)，加入去离子水和实施例1得到的核桃粕粉，搅拌均匀后用0.1m naoh和0.1m hcl调节ph至8.5，继续匀速搅拌2h，在8000r/min条件下离心20min得到上清液并调节ph至其等电点4.5，继续匀速搅拌2h，在8000r/min条件下离心20min，取下层沉淀物，加水充分溶解后，调节ph至7.0，采用40000da透析带透析48h后，将其真空冷冻干燥后得到核桃蛋白，于-20℃保存。
[0086]
(2)以液料比为12:1(v/w)加去离子水和核桃粕蛋白冻干粉，用0.1mol/lnaoh调节ph至7.5，酶解温度调至60℃，添加1.5％(w/w)alcalase 2.4l蛋白酶后水解核桃粕蛋白溶液15h。酶解结束后将酶解液于90℃水浴保温30min灭酶，终止反应。冷却后于8000r/min条件下离心15min，取上清液，得到核桃蛋白酶解产物2，并将其在-20℃冷冻保存。
[0087]
结果：核桃蛋白酶解产物2的蛋白回收率、水解度、乙酰胆碱酯酶抑制率(蛋白浓度为10mg/ml)如图1所示。
[0088]
对比例2
[0089]
(1)以液料比12:1(v/w)，加入去离子水和实施例1得到的核桃粕粉，搅拌均匀后用0.1m naoh和0.1m hcl调节ph至8.5，继续匀速搅拌2h，在8000r/min条件下离心20min得到
上清液并调节ph至其等电点4.5，继续匀速搅拌2h，在8000r/min条件下离心20min，取下层沉淀物，加水充分溶解后，调节ph至7.0，采用40000da透析带透析48h后，将其真空冷冻干燥后得到核桃蛋白，于-20℃保存。
[0090]
(2)以液料比为12:1(v/w)加去离子水和核桃粕蛋白冻干粉，用0.1mol/lnaoh调节ph至7.5，酶解温度调至55℃，添加1.5％(w/w)菠萝蛋白酶后水解核桃粕蛋白溶液15h。酶解结束后将酶解液于90℃水浴保温30min灭酶，终止反应。冷却后于8000r/min条件下离心15min，取上清液，得到核桃蛋白酶解产物3，并将其在-20℃冷冻保存。
[0091]
结果：核桃酶解产物3的蛋白回收率、水解度、乙酰胆碱酯酶抑制率(蛋白浓度为10mg/ml)如图1所示。
[0092]
图1为各核桃蛋白酶解产物的的酶解效果和乙酰胆碱酯酶抑制率结果，由图1可知，采用本发明方法获得的核桃蛋白酶解产物1(实施例1)表现出较高的蛋白回收率、水解度及乙酰胆碱酯酶抑制率。未使用alcalase 2.4l和木瓜蛋白酶的核桃蛋白酶解产物3(对比例2)的蛋白回收率、水解度及乙酰胆碱酯酶抑制率均较低，单独使用alcalase 2.4l的核桃蛋白酶解产物2(对比例1)的蛋白回收率、水解度及乙酰胆碱酯酶抑制率低于核桃蛋白酶解产物1，但显著高于核桃蛋白酶解产物3。核桃蛋白酶解产物2和1最大的区别是缺少了木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的作用位点较多，主要作用于精氨酸、赖氨酸及脯氨酸，大大增加了酶解酶解产物的多样性。同时，alcalase 2.4l是一种专一性广泛的内切蛋白酶，作用范围广，特异性作用于羧基端疏水性氨基酸的肽键，水解效率高。采用单一酶水解蛋白原料，无法兼顾酶解效率和乙酰胆碱酯酶抑制活性，而在多酶协同的作用下酶解效率和乙酰胆碱酯酶抑制活性均有较好的表现。
[0093]
实施例2乙酰胆碱酯酶抑制肽的鉴定及筛选
[0094]
(1)uplc-esi-q-tof-ms/ms多肽组成鉴定
[0095]
将实施例1制备的核桃蛋白酶解产物进行uplc-esi-q-tof-ms/ms测定所含多肽的氨基酸序列及分子量。所用色谱柱为acquity uplc hss t3柱(2.1
×
100mm，1.8μm)，进样体积为5μl，浓度为2.0mg/ml，检测波长为220nm，柱温30℃，洗脱流速为0.2ml/min，以含有0.1％甲酸的超纯水(a)和乙腈(b)为流动相进行梯度洗脱。洗脱程序设定为：0～2min，10％ b；2～10min，10～50％ b；10～13min，50％～10％ b；13～15min，10％b。利用dataanalysis4.4软件进行手动de novo测序，共得到119条多肽序列。
[0096]
(2)uniprot数据库匹配多肽序列
[0097]
uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)搜索比对多肽结构，共得到氨基酸序列在10以下的多肽序列56个。
[0098]
(3)peptide ranker生物活性预测
[0099]
将步骤(2)匹配到的56个肽序列在peptide ranker程序中进行生物活性评分的预测，其中评分大于0.5(表明具有良好生物活性)的有11条肽序列，选择其中10个肽段进行后续筛选。
[0100]
(4)autodock tool肽段虚拟筛选
[0101]
将步骤(3)中10个肽段在autodock tool中与乙酰胆碱酯酶进行对接vina评分。使用chembio3d绘制肽段的3d结构，从rcsb蛋白质数据库下载含有配体的乙酰胆碱酯酶蛋白复合物，对酶的结构进行加氢去水预处理，并保存为pdbqt格式，使用autodock tool软件将
所有肽段设为配体，与乙酰胆碱酯酶受体依次进行对接打分和虚拟筛选，以vina评分预测肽段与乙酰胆碱酯酶结合的亲和力(kcal/mol)，通过对接能大小判断其相互作用力的强弱以筛选肽段。
[0102]
结果：乙酰胆碱酯酶抑制活性的多肽序列及活性预测见表1
[0103]
表1具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的多肽序列及活性预测结果
[0104][0105]
vina评分代表着受体与配体的结合潜力，较低的得分通常对应着两者之间较强的结合能力。将筛选出的peptideranker评分大于0.5的10个肽段在autodock tool中与乙酰胆碱酯酶进行对接vina评分，结果如表1所示。肽段fr、lr、sf与酶的对接能分别为-8.5kcal/mol、-7.8kcal/mol、-7.7kcal/mol。此结果说明fr、sf、lr可能具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制作用，根据其序列进行合成以备后续实验。
[0106]
实施例3核桃多肽体外乙酰胆碱酯酶抑制活性鉴定
[0107]
(1)肽段人工合成
[0108]
将实施例2中所述肽段，采用fmoc固相合成法进行合成，根据氨基酸序列合成肽段，经切割、析出、纯化后得到粉末状多肽，肽段fr、sf、lr均进行脱盐处理，纯度均大于95％。合成过程委托上海吉尔生化有限公司。
[0109]
(2)人工合成肽段活性验证
[0110]
测定肽段fr、sf、lr在浓度为40、80、120、160和200μm下对乙酰胆碱酯酶的抑制率，根据实验结果拟合计算肽段对乙酰胆碱酯酶的的半抑制浓度(ic50值)。fr、sf和lr的体外乙酰胆碱酯酶抑制活性如图2所示，fr的ic50值为134.71μmol/l、和sf的ic50值为161.09μmol/l，lr的ic50值203.91μmol/l，均有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性。
[0111]
实施例4：核桃多肽与乙酰胆碱酯酶autodock vina分子对接，包括以下步骤：
[0112]
使用分子对接软件pymol 1.7软件绘制核桃多肽和乙酰胆碱酯酶相互作用的3d结构示意图并分析相互作用力。图3展示了乙酰胆碱酯酶与多肽结合时产生的相互作用。由fq、fr、lr、sf和ache的相互作用图可以看出，疏水相互作用和氢键是4条多肽与ache之间的主要相互作用力。对接结果表明fr与ache侧链上的tyr341、typ286形成π-π共轭作用，与phe338形成氢键。sf与ache侧链上的tyr337和his447形成π-π共轭作用，与tyr124、trp286形成氢键。而lr与ache侧链上的无π-π共轭作用，与glu202形成氢键。
[0113]
综上所述，本发明的二肽fr、sf、lr可显著抑制ache活性，提高脑中神经递质ach的水平，起到抗老年痴呆的效。
[0114]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。