一种嵌合抗原受体（CAR）以及在治疗肿瘤中的应用的制作方法

：本发明属于疾病治疗领域，具体提供了一种嵌合抗原受体(car)以及在治疗肿瘤中的应用。

背景技术

0、
背景技术：

1、免疫疗法彻底改变了癌症治疗的传统模式，成为了继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗手段，肿瘤免疫疗法中最成功的案例是免疫检查点抑制剂和以嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)t细胞为代表的过继细胞疗法(adoptive celltherapy，act)。在使用传统疗法无法治愈的转移性癌症中，car-t免疫疗法展现了惊人的疗效，一些患者可以实现长期缓解并可能治愈，据报道cd19 car-t治疗复发难治性急性b淋巴细胞白血病(b-all)及复发难治性b细胞非霍奇金淋巴瘤(b-nhl)的完全缓解率(crr)分别是60％～90％和40％～50％；b细胞成熟抗原(bcma)car-t治疗复发难治性多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)的crr为39％～80％(冯友琴，张棋琦，胡永仙，黄河，多靶点car-t治疗血液系统恶性肿瘤研究进展，临床内科杂志2022年9月第39卷第9期)。

2、car通常由四个结构域组成：细胞外抗原结合结构域、间隔区或铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域。抗原结合结构域通常由抗体重链(vh)和轻链(vl)的可变区通过柔性接头连接形成单链片段可变区(scfv)并决定结合特异性；有时，可以使用与其靶细胞上受体结合的天然蛋白质或肽来代替scfv。与识别通过mhc呈递的抗原的tcr不同，car识别并结合细胞表面表位并确定靶标特异性，不依赖于mhc。铰链区是暴露car-t细胞表面上的与靶抗原结合的间隔区，临床常用的铰链区通常来源于cd8、cd28或igg，铰链区的长度由目标抗原的位置凭经验确定，靠近细胞膜的抗原需要较长的铰链，而暴露在细胞表面的抗原需要较短的铰链。跨膜结构域的主要功能是将car停靠在免疫细胞膜上，一些研究表明该区域可以影响car的表达、稳定性、二聚化和信号转导。细胞内信号结构域已在car工程中得到广泛研究，以产生具有最活跃的抗肿瘤免疫的car免疫细胞，与car结合后，它会转导信号以激活免疫细胞进而展开有效攻击。

3、第一代car-t细胞仅包含一个cd3ζ信号域，由于最佳的t细胞启动和激活需要来自tcr-cd3和cd28信号通路的信号，因此第一代car-t细胞疗法在过继转移后治疗效果和持久性均明显不足。为了提高抗癌活性，研究人员设计第二代car-t细胞，除了cd3ζ信号结构域外，它还包含一个共刺激结构域。两个最常用的信号结构域是cd28和4-1bb(cd137)细胞内结构域。cd28域被fda批准的axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel使用，两者都针对cd19。4-1bb信号域被批准的靶向cd19的lisocabtagene maraleucel和tisagenlecleucel以及靶向b细胞成熟抗原(bcma)的idecabtagene vicleucel使用。其他细胞内共刺激结构域，例如ox40、cd27和诱导型t细胞共刺激物(icos)，也已在临床前研究中进行了测试，其疗效与cd28和4-1bb结构域相当。其中一些共刺激结构域可能对car-t细胞具有更好的有益效果，一项研究表明，cd27共刺激比cd28结构域更能增强car-t细胞的体内持久性(song dg,ye q,poussin m,harms gm,figini m,powell djjr.cd27costimulation augments the survival and antitumor activity ofredirected human t cells in vivo.blood.2012；119(3):696–706)。已发现细胞内cd28和4-1bb结构域对car-t细胞分化和代谢具有不同的影响，4-1bb和cd3ζ的组合诱导中枢记忆t细胞分化和持续存在，增加线粒体生物合成，增强脂肪酸氧化和氧化代谢；另一方面，cd28和cd3ζ组合诱导效应记忆细胞分化和糖酵解。为了利用共刺激域的不同特性并增强car-t细胞的功效，研究人员设计了第三代car-t疗法，该疗法除了cd3ζ之外还结合了两个共刺激域，cd28和4-1bb的组合可以挽救对靶抗原亲和力低的car-t细胞，增强增殖能力，增强中枢记忆分化并提高体内抗肿瘤活性。当测试包含可变数量的共刺激结构域的car构建体库时，发现包含两个共刺激结构域dap10和cd27的car-t细胞在体内实现了最佳抗肿瘤活性(huang r,li x,he y,zhu w,gao l,liu y,et al.recent advances in car-t cellengineering.j hematol oncol.2020；13(1):86)。

4、到目前为止，已有五种car-t细胞获得了美国fda的批准，第一个被批准的car-t是kymriah，它于2018年5月1日获批，用于治疗复发或难治性大b细胞淋巴瘤，包括弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、高级别b细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的dlbcl；第二个被批准的car-t是yescarta，于2017年10月18日批准用于治疗大b细胞淋巴瘤，包括dlbcl、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、高级别b细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的dlbcl；第三个靶向cd-19的car-t产品tecartus于2020年7月24日被fda批准用于复发或难治性套细胞淋巴瘤。breyanzi是最近获批的针对复发性或难治性大b细胞淋巴瘤的cd19靶向car-t疗法，经过两种或多种全身治疗，包括dlbcl/高级别b细胞淋巴瘤、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤和3b级滤泡性淋巴瘤。abecma是唯一获得fda批准的不针对cd19的car-t疗法，于2021年3月26日获得fda批准，用于经过四线或更多线全身治疗(包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗cd38单克隆抗体)后的复发或难治性多发性骨髓瘤。

5、尽管取得了较好的疗效，但是免疫疗法仍存在较多的局限性，从而导致car-t细胞治疗失败，主要体现在：

6、理想的肿瘤抗原难以获得，目前已批准的car疗法都是针对b谱系标志物，如cd19、bcma等，虽然靶向cd19的car-t治疗可能导致b细胞再生障碍，但静脉注射免疫球蛋白补充剂可以轻松补偿大部分b细胞功能。然而，实体瘤中很少有这种不影响正常功能的特异性抗原，使得实体瘤中的car-t疗法落后于血液系统恶性肿瘤。

7、car-t细胞运输和浸润肿瘤效率低下，具有粘附分子异常表达的异常脉管系统减少了car-t细胞附着、迁移和浸润到肿瘤部位；致密的细胞外基质，包括癌症相关成纤维细胞，为car-t细胞进入肿瘤部位创造了物理屏障；并且失调的细胞因子表达优先吸引抑制性免疫细胞，也对car-t细胞起到了阻碍作用。

8、肿瘤微环境造成了不利的免疫影响，某些癌症中细胞和基质成分都会为癌症免疫治疗创造不利的微环境，肿瘤相关巨噬细胞、调节性t细胞、髓源性抑制细胞和肿瘤相关成纤维细胞等细胞成分可以直接抑制car-t功能，vegf、tgf-β、il-4、il-10和许多其他物质也会导致t细胞功能障碍并抑制免疫细胞的浸润，其中tgf-β是主要的抑制因子(jordanhartley,hinrich abken,chimeric antigen receptors designed to overcometransforming growth factor-β-mediated repression in the adoptive t-celltherapy of solid tumors,clin transl immunology.2019jun 22；8(6):e1064)，tgf-β通过与tgf受体tgfbr1和tgfbr2结合，直接抑制t细胞活性；tgf-δ结合诱导各自受体的异源二聚体化和主要tgf-γ信号介质smad2和smad3的磷酸化，磷酸化smad诱导抑制转录程序，导致细胞因子生成减少，抗原结合后的细胞毒性和t细胞扩增；tgf-β也能促使t细胞分化为调节性t细胞，调节性t淋巴细胞又能产生tgf-α，进一步促进免疫抑制和肿瘤耐受。为此，有研究人员提出，使用tgf-β抑制剂以消除或降低tgf-β对car-t细胞的不利影响。

9、.肿瘤细胞逃逸，car-t细胞发挥抗癌活性后，抗原丢失和下调是治疗失败的重要机制，据统计尽管初始反应率很高，但7-25％的接受靶向cd19的car-t疗法治疗的患者会因cd19表达减少而导致恶性肿瘤复发(majzner rg,mackall cl.tumor antigen escapefrom car-t-cell therapy.cancer discov.2018；8(10):1219–26)。

10、car-t细胞扩增和持久性不足，除免疫逃逸外，car-t细胞在体内的扩增和持久性被认为是长期缓解的关键，特别是对于那些需要长期治疗的恶性肿瘤，如急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)。缺乏car-t细胞持久性可能与宿主对car-t细胞的抗转基因免疫反应有关，如使用氟达拉滨进行淋巴清除，可以减少抗转基因免疫反应，改善car-t细胞的扩增和持久性，并增强car-t细胞的功效。研究人员相信，除给药方式之外，缺乏car-t细胞扩增和持久性与car-t细胞本身因素直接相关，包括car-t构建、亲代t细胞选择、t细胞培养条件、药理学操作、car-t基因表达和代谢的修饰、t细胞衰竭的逆转、促进记忆表型发展等。关于car-t结构，大多数临床试验并获得fda批准的car-t细胞产品都含有cd3ζ和一个共刺激结构域，通常是cd28或4-1bb，一些临床研究观察到4-1bb结构域的持续时间更长，可达到168天，而基于cd28的car-t细胞约为30天。离体培养、激活和扩增不仅为转导car转基因的t细胞做好准备，扩增以产生足够的car-t细胞用于临床应用，而且对于维持car-t功能和输注后的持久性至关重要。导致t细胞终末分化并具有激活诱导细胞死亡(aicd)和衰竭倾向的离体培养会影响体内扩增和持久性，培养条件的优化可以改善记忆car-t细胞的发育和体内扩增和持久性。

11、为了克服上述困难，本发明中提供了一种新型嵌合抗原受体及其递送系统，一方面所述嵌合抗原受体具有靶向cd19的全新抗原结合域，采用cd27和cd28作为双共刺激因子，能够提高car-t细胞的持久性，促进细胞增殖；另一方面，以脂质体为递送基础，脂质体内部包裹携带嵌合抗原受体的核酸载体和抗tgf-β的sirna，外部结合cd8抗体，可在体内靶向结合cd8+t细胞，并合成自体car-t细胞，既能够避免体外制备car-t细胞的繁琐过程，又能够延长car-t细胞的时间，进而提高肿瘤治疗效果。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明中提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、靶向cd19的抗原结合片段、铰链区、跨膜区、胞内信号域cd27、cd28和cd3ζ区域，所述靶向cd19的抗原结合片段具有轻链可变区和重链可变区，所述嵌合抗原受体还包括信号肽、靶向cd19的抗原结合片段、铰链区、跨膜区、胞内信号域cd27、cd28和cd3ζ区域，所述靶向cd19的抗原结合片段具有轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示。

2、cd19是已知的在多种血液肿瘤中高水平表达的肿瘤靶点，本发明中以其为目标抗原，筛选并获得了能够有效识别cd19的抗原结合片段，且该抗原结合片段与目标抗原具有较高的结合活性，可防止脱靶现象出现。此外，共刺激因子是激发和维持car-t细胞生理活性的关键因素之一，有研究表明，通过tgf-β的car t细胞抑制可以通过cd28ζcar在与同源抗原结合时提供的cd28共刺激来克服，而4-1bb-cd3ζcar和第一代cd3ζcar-t细胞受到抑制(golumba-nagy v,kuehle j,hombach aa,abken h,cd28-ζcar t cells resist tgf-βrepression through il-2signaling,which can be mimicked by an engineered il-7autocrine loop.mol ther 2018；26:2218–2230)。也有研究表明，在临床前实验中，含有cd28的car与4-1bb共刺激结构域相比，细胞因子释放通常更大，对肿瘤细胞的杀伤作用更为猛烈(kathryn m.cappell，james n.kochenderfer，a comparison of chimericantigen receptors containing cd28 versus 4-1bb costimulatory domains，naturereviews clinical oncology，2021,18：715–727)。因此，为了降低tgf-β的不利影响，同时提高抗肿瘤效果，本发明中选用cd28作为共刺激因子；并且为了提高car-t细胞的持续时间，使用cd27和cd28两种共刺激因子构建嵌合抗原受体。

3、进一步的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no:3所示。

4、提供了一种基因递送药物，所述药物采用脂质体包裹核酸表达载体和抗tgf-β的sirna，所述核酸表达载体携带编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列；所述脂质体表面修饰有cd8抗原结合片段，所述cd8抗原结合片段为单域抗原结合片段，其氨基酸序列如seq idno:4所示；所述抗tgf-β的sirna包括sirna-01和sirna-02，sirna-01的正义核苷酸序列为gagcaccauucuccuugaaaggacu，反义核苷酸序列为aguccuuucaaggagaauggugcuc；sirna-02的正义核苷酸序列为gcaacaacgccaucuaugatt，反义核苷酸序列为ucauagauggcguuguugctt。

5、纳米递送系统可用于将dna或mrna等核酸递送至细胞，促进体内外源因子的表达，这种技术在基因药物、核酸疫苗的研究中得到了广泛应用。近年来，有研究人员尝试通过纳米递送系统负载car基因，并取得了一定的研究进展。例如，joel g rurik等(joel grurik,istván tombácz et al,car t cells produced in vivo to treat cardiacinjury,science.2022jan 7；375(6576):91-96)公开了一种治疗心脏纤维化的car-t疗法，通过在t细胞靶向脂质纳米粒(lipid nanoparticles，lnps)中传递修饰的信使rna(mrna)，编码car的修饰mrna高效地传细胞，递给t淋巴细胞，从而在体内产生短暂有效的car-t细胞，进而减少损伤后的纤维化并恢复心脏功能。这种方式可在体内快速生成car-t细胞，但以mrna为表达介质，为一种短暂的瞬时治疗方式。在肿瘤治疗中，人们更倾向于使用长效治疗手段，以便有效抑制肿瘤复发，因此研究人员也尝试采用lnp负载dna载体，如jing-ezhou等(jing-e zhou,lei sun et al,lipid nanoparticles produce chimeric antigenreceptor t cells with interleukin-6knockdown in vivo,journal ofcontrolledrelease,2022,35,298-307)构建了一个经cd3抗体修饰的脂质纳米粒系统，并装载含有白细胞介素6短发夹rna(il-6shrna)和cd19-car(anticd3 lnp/car19+shil6)结合基因的质粒，该系统通过cd3抗体介导靶向t细胞，稳定转染t细胞，将其转化为具有il-6敲除功能的car-t细胞，从而杀死cd19高表达白血病肿瘤细胞，降低il-6引起的crs。

6、相比于现有技术在lnp复合物中使用的cd3、cd5等表面抗原，cd4和/或cd8+t细胞对于car-t细胞的抗肿瘤活性和持久性更为重要，并且几个临床前模型证明了不同t细胞亚群对有效car-t治疗的优势：cd8(+)cd45ra(+)ccr7(+)car-t细胞与t记忆干细胞表型细胞最接近，产生更大的car-t抗肿瘤活性(xu y,zhang m et al.closely related t-memorystem cells correlate with in vivo expansion of car.cd19-t cells and arepreserved by il-7and il-15.blood.2014；123:3750–3759)，因此本发明中使得lnp复合物连接抗cd8抗体，以便形成活性更强的car-t细胞，进而发挥良好的抗肿瘤作用。

7、此外，在lnp复合物中还包裹了抗tgf-β的sirna，可以抑制tgf-β的表达，从而解除其对于t细胞的免疫抑制，提高抗肿瘤效果。所述sirna包括两组sirna，是从现有技术中筛选获得的靶向人、鼠、猴等哺乳动物tgf-β保守区的干扰rna，具有一定的通用性、广谱性和高效性。

8、进一步的，所述药物的制备方法包括如下步骤：将编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列导入哺乳动物表达载体中，以大豆卵磷脂、胆固醇和dmg-peg2000构建脂质体纳米颗粒lnp，使得所述lnp包裹所述哺乳动物表达载体和所述抗tgf-β的sirna；然后使得所述lnp表面结合所述cd8抗原结合片段，从而获得纳米递送药物颗粒

9、提供了本发明所述的嵌合抗原受体和/或基因递送药物在制备抗肿瘤制剂中的应用

10、进一步的，所述肿瘤为白血病、淋巴瘤和/或骨髓瘤。

11、有益效果

12、本发明提供了一种嵌合抗原受体及其核酸递送系统，以及在治疗肿瘤中的应用，具有以下优势：

13、(1)选用与目标抗原cd19具有较高亲和力的抗原结合片段，能够高效识别目标抗原，从而发挥强力抗肿瘤效果；

14、(2)选用cd27和cd28作为双共刺激因子，提高t细胞的激活程度，并大幅度延长car-t细胞在体内的持续时间，能够发挥长效抗肿瘤作用；

15、(3)构建纳米脂质体药物递送系统，该脂质体包裹哺乳动物细胞表达载体，实现了在体内car-t细胞的组装，避免了体外人工制备car-t的繁琐过程，降低了生产、运输和储存成本；

16、(4)脂质体包裹抗tgf-β的sirna，可有效抑制tgf-β表达，解除对于t细胞的免疫抑制，提高其抗肿瘤活性；

17、(5)纳米脂质体药物递送系统外部使用抗cd8抗体修饰，能够有效捕获cd8+t细胞，进而产生具有强烈抗肿瘤活性的car-t细胞，改善肿瘤治疗效果。