一种金纳米粒子的生物合成方法及应用

1.本发明属于纳米材料的制备和生物制氢技术领域，涉及一种金纳米粒子的生物合成方法及应用。


背景技术：

2.由于较高的表面积，以及表面等离子体共振效应(lspr)，金纳米粒子被认为是一种有前途的催化剂。此外，基于金纳米粒子化学稳定性、高生物相容性等独特的性质，金纳米粒子还广泛应用在药物输送，光热疗法，化妆品，生物传感器等生物医学领域。然而，目前的金纳米粒子合成方法主要采取各种物理和化学法，化学法在合成过程使用各种有毒试剂或者后期应用时安全问题无法得到有效保障，使得化学法并不绿色环保，限制了金纳米粒子在各种生物学领域的应用。因此，有必要开发合成低毒性，生物相容性高、环保的金纳米粒子合成方法。
3.金纳米粒子的生物合成是通过利用植物提取液或微生物还原金盐离子溶液来实现的，该过程中植物提取液或微生物充当还原剂的同时还充当了稳定剂和封端剂，不需要额外添加稳定剂。金纳米粒子的生物合成法基于其环保、非致病、经济，合成条件温和等优点而成为一种有前景的金纳米粒子制备方法。
4.然而生物法合成金纳米粒子的方法目前并不成熟，生物法合成金纳米粒子的时间、温度等因素均会影响金纳米粒子的合成，并且生物法合成金纳米粒子的尺寸和形状仍需进一步优化(ahmed s,ikram s.biosynthesis of gold nanoparticles:a green approach[j].journal of photochemistry and photobiology b:biology,2016,161:141-153)。因此有必要开发一种快速、简便的金纳米粒子生物合成方法。


技术实现要素：

[0005]
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术存在的问题提供一种金纳米粒子的生物合成法，该生物合成方法具有反应条件温和，环境友好、操作简便易行等优点，所合成的金纳米粒子具有高生物相容性和催化活性。将该方法制备的金纳米粒子与产氢菌构成的混合体系进行厌氧培养光发酵制氢，混合体系的氢气产量显著高于裸露丁酸梭菌光/暗发酵的氢气产量。
[0006]
为此，本发明第一方面提供了一种金纳米粒子的生物合成方法，其包括以金离子作为金纳米粒子前体，以为微生物为生物催化剂进行金离子的还原反应获得金纳米粒子。
[0007]
根据本发明，所述生物合成方法包括制备金纳米粒子的步骤，所述制备金纳米粒子的步骤包括将作为金纳米粒子前体的金离子与生物催化剂和还原反应溶剂混合后进行金离子的还原反应，获得含有金纳米粒子的菌液；在所述含有金纳米粒子的菌液中，金纳米粒子以游离的金纳米粒子的形式存在和/或以金纳米粒子—生物催化剂杂化体的形式存在。
[0008]
本发明中，所述金离子为能够在水中解离出金离子的金酸和/或金盐，其包括氯金
酸、硫代硫酸金钠和氯化金中的一种或几种。
[0009]
在本发明的一些实施例中，所述金离子的工作浓度为0.25～2mmol/l，更优选为0.5～1mmol/l。
[0010]
本发明中，所述生物催化剂包括丁酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜式梭菌，产气肠杆菌和大肠杆菌中的一种或几种。
[0011]
在本发明的一些实施例中，所述生物催化剂的工作浓度为od600值为0.1～5。
[0012]
优选地，所述还原反应溶剂包括细菌培养基、生理盐水、磷酸盐缓冲液和水中的一种或者几种，更优选为细菌培养基或生理盐水；进一步更为优选地，所述细菌培养基包括强化梭菌培养基和培养肠杆菌的lb培养基。
[0013]
在本发明的一些实施例中，所述还原反应的温度为25-40℃，优选为37-40℃。
[0014]
在本发明的一些实施例中，所述还原反应的时间为6～48h，优选为12～36h，进一步优选为24-36h。
[0015]
在本发明的一些实施例中，所述还原反应的转速为0～180rpm，优选为120-180rpm。
[0016]
根据本发明，所述生物合成方法还包括分离纯化金纳米粒子和/或金纳米粒子—生物催化剂杂化体的步骤，对含有金纳米粒子的菌液中的金纳米粒子和/或金纳米粒子—生物催化剂杂化体进行分离纯化，获得金纳米粒子成品和/或金纳米粒子—生物催化剂杂化体成品。
[0017]
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的生物合成方法制得的金纳米粒子。
[0018]
本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的生物合成方法制得的金纳米粒子—生物催化剂杂化体，其由金纳米粒子均匀附着在整个生物催化剂上构成。
[0019]
本发明中，所述生物催化剂包括丁酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜式梭菌，产气肠杆菌和大肠杆菌中的一种或几种，优选为丁酸梭菌。
[0020]
本发明第四方面提供了一种如本发明第一方面所述的生物合成方法制得的金纳米粒子在生物制氢中的应用。
[0021]
根据本发明，所述应用包括制备含有金纳米粒子的产氢培养体系的步骤，其包括将金纳米粒子和产氢菌接入产氢培养液中混合后形成含有金纳米粒子的产氢培养体系。
[0022]
优选地，所述产氢菌为丁酸梭菌，相应地，所述产氢培养液为丁酸梭菌产氢培养液。
[0023]
在本发明的一些优选的实施例中，制备含有金纳米粒子的产氢培养体系的步骤包括将本发明第一方面所述的生物合成方法中制得的含有金纳米粒子的菌液接入产氢培养液中混合后形成含有金纳米粒子的产氢培养体系，其中，在所述含有金纳米粒子的菌液中，金纳米粒子以游离的金纳米粒子的形式存在和/或以金纳米粒子—生物催化剂杂化体的形式存在，优选以金纳米粒子—生物催化剂杂化体的形式存在。
[0024]
优选地，所述产氢培养体系中含有金纳米粒子的菌液的接种量为发酵体系总体积的5％-20％，优选为10％-20％。
[0025]
根据本发明，所述应用还包括生物产氢培养的步骤，其包括对含有金纳米粒子的产氢培养体系进行生物产氢培养。
[0026]
优选地，所述生物产氢培养的光源包括led可见光、自然光和氙灯中的一种或几种。
[0027]
在本发明的一些实施例中，所述生物产氢培养的光照强度为0-5mw/cm2，优选为2.5mw/cm2。
[0028]
本发明的有益效果在于，本发明方法制备的金纳米粒子形状和尺寸大小可以通过反应时间来调控，并且能够直接应用于金纳米粒子合成菌(合成金纳米粒子的生物催化剂)的生物催化反应中，显著提升金纳米粒子合成菌(合成金纳米粒子的生物催化剂)的目标物生产能力；例如，以严格厌氧产氢菌丁酸梭菌作为生物法合成金纳米粒子的生物催化剂时，能够合成粒径大小均一，形状规则的金纳米粒子(生理盐水体系0.5mm氯金酸)，而丁酸梭菌合成的金纳米粒子能够在光照下显著促进丁酸梭菌厌氧发酵产氢能力。本发明中的金纳米粒子合成方法具有操作简便，环境友好的优点，所合成的金纳米粒子具有高生物相容性和催化活性的优点。同时，采用本发明方法所制备的金纳米粒子-生物催化剂(例如，丁酸梭菌)杂化体，接种在丁酸梭菌产氢发酵体系中进行光发酵，杂化体系的产氢能力显著高于裸露游离的丁酸梭菌。
附图说明
[0029]
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
[0030]
图1为本发明实施例1的实验组所制得的金纳米粒子与丁酸梭菌的透射电镜图：(a)强化梭菌培养基中丁酸梭菌培养24h后的透射电子显微镜明场照片，(b)强化梭菌培养基中丁酸梭菌还原0.5mm的氯金酸24h后丁酸梭菌与金纳米粒子杂化体在透射电镜明场下的形貌，(c)强化梭菌培养基中丁酸梭菌还原0.5mm的氯金酸24h后丁酸梭菌与金纳米粒子杂化体在透射电镜暗场下的形貌；(d)强化梭菌培养基中丁酸梭菌还原2mm的氯金酸24h后丁酸梭菌与金纳米粒子杂化体在透射电镜明场下的形貌；(e)生理盐水中丁酸梭菌还原0.5mm的氯金酸24h后丁酸梭菌与金纳米粒子杂化体在透射电镜明场下的形貌；(f)生理盐水中丁酸梭菌还原0.5mm的氯金酸24h后丁酸梭菌与金纳米粒子杂化体在透射电镜暗场下的形貌；(g)生理盐水中丁酸梭菌还原2mm的氯金酸24h后丁酸梭菌与金纳米粒子杂化体在透射电镜明场下的形貌。
[0031]
图2为本发明的实施例2中不同微生物对氯金酸的还原效率图
[0032]
图3为本发明的实施例3中丁酸梭菌对不同浓度氯金酸的还原效率图。
[0033]
图4示出本发明的实施例4中在生理盐水和强化梭菌培养基两种溶剂中丁酸梭菌对0.5mm氯金酸的还原效率随时间变化曲线。
[0034]
图5为本发明实施例5中金纳米粒子与丁酸梭菌杂化体暗/光发酵144h的累积氢气产量柱状图。
具体实施方式
[0035]
为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
[0036]
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常
理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
[0037]ⅰ.术语
[0038]
本发明中所述“水”一词，在没有特别说明或限定的情况下是指去离子水、蒸馏水或超纯水。
[0039]
本发明所述用语“工作浓度”是指该反应物在反应体系中的浓度。
[0040]
本发明所述用语“发酵体系”是指用于发酵产氢的改进型强化梭菌培养液/基。
[0041]ⅱ.实施方案
[0042]
如前所述，目前生物法合成金纳米粒子的方法并不成熟，生物法合成金纳米粒子的时间、温度等因素均会影响金纳米粒子的合成，并且生物法合成金纳米粒子的尺寸和形状仍需进一步优化。鉴于此，本发明人对于生物法合成金纳米粒子技术进行了大量的研究。
[0043]
本发明人研究发现，以氯金酸作为金纳米粒子的前体，利用丁酸梭菌对氯金酸进行还原制备金纳米粒子，简便、快速、反应条件温和，且所合成的金纳米粒子具有高生物相容性和催化活性。
[0044]
本发明人进一步研究发现，以金离子作为金纳米粒子前体，以为微生物为生物催化剂进行金离子还原反应，随着还原反应的进行，在一定反应时间内所获得含有金纳米粒子的菌液中，大量金纳米粒子以金纳米粒子—生物催化剂杂化体的形式存在；而且，本发明人研究发现，将含有金纳米粒子-生物催化剂(例如，丁酸梭菌)杂化体的菌液接种在丁酸梭菌产氢发酵体系中进行光发酵，杂化体系的产氢能力显著高于裸露游离的丁酸梭菌。
[0045]
另外，本发明人注意到，生物氢是一种清洁绿色的可再生能源，然而低的氢气得率始终制约着生物氢的工业化生产。因此，本发明人研究并尝试利用所合成的金纳米粒子影响金纳米粒子合成菌的催化活性的特点建立高效金纳米粒子—生物杂化体高效光生物催化产氢体系，用以制氢，氢气产量明显高于裸露的丁酸梭菌体系。基于上述获得本发明。
[0046]
因此，本发明第一方面所涉及的金纳米粒子的生物合成方法主要是以金离子作为金纳米粒子前体，以为微生物为生物催化剂进行金离子的还原反应获得金纳米粒子。
[0047]
具体地，本发明中所述金纳米粒子的生物合成方法包括制备金纳米粒子的步骤，其包括将作为金纳米粒子前体的金离子与生物催化剂和还原反应溶剂混合后进行金离子的还原反应，获得含有金纳米粒子的菌液；在所述含有金纳米粒子的菌液中，金纳米粒子以游离的金纳米粒子的形式和/或金纳米粒子—生物催化剂杂化体的形式存在。
[0048]
在本发明的一些实施例中，含有金纳米粒子的菌液中含有金纳米粒子—生物催化剂杂化体和生物催化剂。
[0049]
在本发明的另一些实施例中，含有金纳米粒子的菌液中含有金纳米粒子—生物催化剂杂化体、生物催化剂和极少量的游离的金纳米粒子。
[0050]
本发明中，所述金离子为能够在水中解离出金离子的金酸和/或金盐，这可以理解为所述金离子是以能够在水中解离出金离子的金酸和/或金盐的形式存在，其包括氯金酸(haucl4)、硫代硫酸金钠和氯化金中的一种或几种，优选为金氯酸。
[0051]
在本发明的一些实施例中，所述金离子的工作浓度为0.25～2mmol/l，更优选为0.5～1mmol/l。
[0052]
研究结果表明，在制备金纳米粒子的过程中，所述生物催化剂采用丁酸梭菌、丙酮
丁醇梭菌、拜式梭菌、产气肠杆菌和大肠杆菌中的任意一种均能够较好地将金离子还原为金纳米粒子。而且，由于后续生物制氢过程采用具有高生物氢合成活性的丁酸梭菌作为产氢菌，因此，为直接将含有金纳米粒子的菌液用于制氢，简化工艺过程，优选在制备金纳米粒子的过程中采用丁酸梭菌为生物催化剂。
[0053]
在本发明的一些实施例中，所述生物催化剂的工作浓度为od600值为0.1～5。
[0054]
本发明中，所述还原反应溶剂包括细菌培养基、生理盐水、磷酸盐缓冲液和水中的一种或者几种，更优选为细菌培养基或生理盐水；进一步更为优选地，所述细菌培养基包括强化梭菌培养基和培养肠杆菌的lb培养基。
[0055]
本发明人研究设计采用细菌培养基作为还原反应溶剂，主要考虑有利于保持菌种的活性，但是经过试验研究发现，采用细菌培养基作为还原反应溶剂对于还原反应的进行也较为有利。然而，出人意料的是，以金离子作为金纳米粒子前体，以微生物为生物催化剂进行金离子的还原反应在生理盐水、磷酸盐缓冲液中，甚至在水中都能够很好地进行，尤其是以生理盐水作为还原反应溶剂时，还原反应效率大于以磷酸盐缓冲液和水为还原反应溶剂，甚至明显高于采用细菌培养基作为还原反应溶剂的还原效率。
[0056]
进一步的研究发现，采用本发明的生物合成方法进行金离子的还原反应可以在很温和的条件下进行。
[0057]
例如，在本发明的一些实施例中，所述还原反应的温度为25-40℃，优选为37-40℃，更优选为37℃。
[0058]
又例如，在本发明的一些实施例中，所述还原反应的时间为6～48h，优选为12～36h，更优选为24-36h，进一步更优选为24h。
[0059]
再例如，在本发明的一些实施例中，所述还原反应的转速为0～180rpm，优选为120-180rpm。
[0060]
根据本发明，所述生物合成方法还包括分离纯化金纳米粒子和/或金纳米粒子—生物催化剂杂化体的步骤，对含有金纳米粒子的菌液中的金纳米粒子和/或金纳米粒子—生物催化剂杂化体进行分离纯化，获得金纳米粒子成品和/或金纳米粒子—生物催化剂杂化体成品。
[0061]
本发明中对于游离的金纳米粒子进行分离纯化没有特别的限制或要求，只要能够分离获得游离的金纳米粒子单体即可。例如，由于金纳米粒子及金纳米粒子—生物催化剂杂化体在含有金纳米粒子的菌液中会发生自沉淀，因此，可以采用离心分离的方法分离纯化金纳米粒子及金纳米粒子—生物催化剂杂化体，并可以通过灼烧的方式烧去金纳米粒子—生物催化剂杂化体中的碳成分(即生物催化剂)，获得游离的金纳米粒子成品。
[0062]
本发明中对于金纳米粒子—生物催化剂杂化体进行分离纯化没有特别的限制或要求，只要能够分离获得金纳米粒子—生物催化剂杂化体即可。例如，由于金纳米粒子及金纳米粒子—生物催化剂杂化体在含有金纳米粒子的菌液中会发生自沉淀，因此，可以采用离心分离的方法分离纯化金纳米粒子及金纳米粒子—生物催化剂杂化体。
[0063]
本领域技术人员应该了解的是，本发明中金纳米粒子—生物催化剂杂化体用于制氢的话可以不需要分离，自沉淀出来的杂化体系可以直接接种到发酵体系用于产氢。
[0064]
本发明第二方面所涉及的如本发明第一方面所述的生物合成方法中制得的金纳米粒子，主要是指采用上述金纳米粒子的生物合成方法制得的游离的金纳米粒子。
[0065]
研究结果表明，本发明方法制备的金纳米粒子形状和尺寸大小可以通过反应时间来调控，并且能够直接应用于金纳米粒子合成菌(合成金纳米粒子的生物催化剂)的生物催化反应中，显著提升金纳米粒子合成菌(合成金纳米粒子的生物催化剂)的目标物生产能力；例如，以严格厌氧产氢菌丁酸梭菌作为生物法合成金纳米粒子的生物催化剂时，能够合成粒径大小均一，形状规则的金纳米粒子(生理盐水体系0.5mm氯金酸)，而丁酸梭菌合成的金纳米粒子能够在光照下显著促进丁酸梭菌厌氧发酵产氢能力。本发明中的金纳米粒子合成方法具有操作简便，环境友好的优点，所合成的金纳米粒子具有高生物相容性和催化活性的优点。
[0066]
本发明中所提供的游离的金纳米粒子既可以应用于生物制氢也可以应用于其他用途。
[0067]
本发明第三方面所涉及的如本发明第一方面所述的生物合成方法中制得的金纳米粒子—生物催化剂杂化体，是由金纳米粒子均匀附着分布在整个生物催化剂上构成。
[0068]
优选地，所述生物催化剂包括丁酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜式梭菌，产气肠杆菌和大肠杆菌中的一种或几种，更优选为丁酸梭菌。
[0069]
本发明第四方面所涉及的如本发明第一方面所述的生物合成方法制得的金纳米粒子在生物制氢中的应用可以理解为利用如本发明第一方面所述的生物合成方法制得的金纳米粒子进行生物制氢的方法，其也可以理解为将如本发明第一方面所述的生物合成方法制得的金纳米粒子应用于强化生物暗/光发酵制氢的方法。
[0070]
根据本发明，所述应用包括制备含有金纳米粒子的产氢培养体系的步骤，其包括将金纳米粒子和产氢菌接入产氢培养液中混合后形成含有金纳米粒子的产氢培养体系。
[0071]
优选地，所述产氢菌为丁酸梭菌，相应地，所述产氢培养液为丁酸梭菌产氢培养液。因此，上述应用也可以理解为如本发明第一方面所述的生物合成方法制得的金纳米粒子在丁酸梭菌制氢中的应用。
[0072]
在本发明的一些优选的实施例中，制备含有金纳米粒子的产氢培养体系的步骤包括将本发明第一方面所述的生物合成方法中制得的含有金纳米粒子的菌液接入产氢培养液中混合后形成含有金纳米粒子的产氢培养体系；其中，所述金纳米粒子以金纳米粒子—丁酸梭菌杂化体的形式存在含有金纳米粒子的菌液中。
[0073]
优选地，所述产氢培养体系中含有金纳米粒子—丁酸梭菌杂化体的菌液的接种量为发酵体系总体积的5％-20％，优选为10％-20％。
[0074]
根据本发明，所述应用还包括生物产氢培养的步骤，其包括对含有金纳米粒子的产氢培养体系进行生物产氢培养，生产氢气。
[0075]
优选地，所述生物产氢培养的光源包括led可见光、自然光和氙灯中的一种或几种。
[0076]
在本发明的一些实施例中，所述生物产氢培养的光照强度为0-5mw/cm2，优选为2.5mw/cm2。
[0077]
在本发明的一些具体实施例中，所所述金纳米粒子的生物合成法包括：以氯金酸为金纳米粒子前体，以丁酸梭菌为生物催化剂，将氯金酸和丁酸梭菌在丁酸梭菌培养液中震荡培养一定时间后，便能得到含有金纳米粒子-丁酸梭菌杂化体和及少量游离的金纳米粒子的菌液，经过离心(5000rpm离心5min)后，将其接种在丁酸梭菌产氢培养基中进行光发
酵，杂化体系的产氢能力显著高于裸露丁酸梭菌。该金纳米粒子制备方法具有操作简便，绿色环保，生物相容性高等优点。这充分说明本发明制得的金纳米粒子能够应用于增强产氢菌光发酵制氢。
[0078]
本发明所涉及的检测和计算方法如下：
[0079]
金离子还原效率＝(总金浓度
–
游离金浓度)*100/总金浓度
[0080]
本发明中培养液中总金浓度采用725es型agilent icp-oes测定。在测游离金浓度时，首先将含有金纳米粒子-丁酸梭菌杂化体的菌液在5000rpm离心5min，取离心后的上清液采用725es型agilent icp-oes测定菌液中含有的游离金元素浓度。
[0081]
本发明所涉及的菌种培养配方如下：
[0082]
(1)大肠杆菌和产气肠杆菌的lb培养基配方(1l)：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l；氯化钠10g/l，加入1l去离子水，高压灭菌锅121℃灭菌20min或者116℃灭菌25min，自然降温至室温作为肠杆菌培养液使用。
[0083]
(2)强化梭菌培养基配方(1l)：酵母粉3g，牛肉粉l0g，蛋白胨10g，可溶性淀粉lg，葡萄糖5g，乙酸钠3g，nacl5g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，加入1l去离子水，ph＝6.8
±
0.2，高压灭菌锅121℃灭菌20min或者116℃灭菌25min，自然降温至室温作为梭菌培养液使用。
[0084]
(3)改进型强化梭菌培养基配方(1l)：酵母粉3g，牛肉粉l0g，蛋白胨10g，可溶性淀粉lg，葡萄糖10g，乙酸钠3g，nacl5g，l-半胱氨酸盐酸盐1.5g，加入1l去离子水，ph＝6.8
±
0.2，高压灭菌锅121℃灭菌20min或者116℃灭菌25min，自然降温至室温作为发酵产氢的培养液。
[0085]ⅲ.实施例
[0086]
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
[0087]
以下实施例涉及以下菌种：
[0088]
大肠杆菌escherichia coli jm109(bncc353808)，北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。
[0089]
产气肠杆菌enterobacteraerogenes(cgmcc：1.4539)，中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0090]
丙酮丁醇梭菌clostridium acetobutylicum(cgmcc：1.5074)，中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0091]
拜式梭菌clostridium beijerinckii(cgmcc：1.5077)，中国普通微生物菌种保藏管理中心
[0092]
丁酸梭菌clostridium butyricum(cicc：23847)，中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0093]
实施例1：丁酸梭菌还原氯金酸合成金纳米粒子的形貌
[0094]
将20ml在液体强化梭菌培养基中培养12h的丁酸梭菌菌液在5000rpm离心5min后弃掉上清液，加入20ml无菌的强化梭菌培养基或者无菌生理盐水，并加入过滤除菌的氯金酸溶液，使得氯金酸的浓度为0.5mm或2mm，菌液的od600为2.74，密封后在37℃培养箱中静置培养24h。将含有金纳米粒子的菌液5000rpm离心5min处理后，加入冷却的2.5％的戊二醛固定液4℃冷藏12h，然后倒掉2.5％戊二醛固定液，用100mm，ph＝7.4pbs缓冲液漂洗样品三
次，每次15min；然后用依次用不同浓度(30％，50％，70％，80％，90％和无水乙醇六种浓度)的乙醇水溶液对样品脱水，每次15min，再用100％的乙醇处理20min，然后菌悬液滴在铜网上，晾干后在jeol jem-f200型透射电镜中观察形貌。
[0095]
结果如图1所示，在无氯金酸的体系中，丁酸梭菌表面光滑，没有黑色的颗粒存在[见图1(a)]。在将含有0.5mm氯金酸的丁酸梭菌混合液培养24h后，透射电镜明场下的丁酸梭菌表面存在明显的黑色金纳米粒子[见图1(b)]，并且透射电镜暗场中整个丁酸梭菌细胞呈现出贵金属元素所特有的亮光，表明丁酸梭菌合成的金纳米粒子均匀分布在整个梭菌细胞上[见图1(c)]，并且金纳米粒子的粒径非常的小，无法观察到明显的黑色金颗粒。图1(d)则是将氯金酸的浓度提高4倍后(2mm)丁酸梭菌还原生成的金纳米粒子形貌图，可以观察到明显的黑色球形金颗粒，粒径在100nm左右，并且丁酸梭菌表面存在明显的孔洞，球形的金纳米粒子已从细胞上脱离。将含有0.5mm氯金酸和丁酸梭菌混合在生理盐水中培养24h后，透射电镜明场下的丁酸梭菌表面存在明显的球形黑色金纳米粒子[见图1(e)]，粒径在20nm左右，并且透射电镜暗场中具有特征亮光的金纳米粒子分布在整个细胞表面，表明生理盐水中丁酸梭菌合成的金纳米粒子均匀分布在整个梭菌细胞表面[见图1(f)]。图1(g)则是将氯金酸的浓度提高4倍后(2mm)生理盐水中丁酸梭菌还原生成的金纳米粒子形貌图，细胞表面没有破洞，合成的金纳米粒子仍然有部分附着在细胞表面，但金纳米粒子的形状多元化，除了球形之外，还出现三面体，五面体和六面体等。图1表明，在强化梭菌培养基和生理盐水中丁酸梭菌细胞都能够还原氯金酸生成金纳米粒子，并且氯金酸的浓度为0.5mm时，强化梭菌培养基中合成的金纳米粒子粒径非常小，而在生理盐水中的金纳米粒子粒径大小均一，形状多为规则球形，并且多附着在梭菌细胞上。当氯金酸浓度达到2mm时，强化梭菌培养基中还原出的金纳米粒子已从细胞表面脱落，呈现出规则的球形纳米粒子；而生理盐水中还原出的金纳米粒子有部分仍附着在细胞表面，并且金纳米粒子的形状多元化。
[0096]
实施例2：不同微生物对金离子的还原效果
[0097]
将20ml在培养液(大肠杆菌和产气肠杆菌采用lb培养基培养，丙酮丁醇梭菌，丁酸梭菌，拜式梭菌采用强化梭菌培养基培养)中培养12h的大肠杆菌，产气肠杆菌，丙酮丁醇梭菌，拜式梭菌，丁酸梭菌5000rpm离心5min后弃掉上清液，分别加入新鲜的无菌液体培养基(大肠杆菌和产气肠杆菌加入lb培养基，丙酮丁醇梭菌，丁酸梭菌，拜式梭菌则加入强化梭菌培养基)和过滤除菌的氯金酸，使得氯金酸的浓度为0.5mm，然后将其放入37℃培养箱中静置培养，其中丙酮丁醇梭菌，丁酸梭菌，拜式梭菌体系严格密封。培养24h后取含有自沉淀金纳米粒子的菌液，将含有金纳米粒子的菌液和上清液(5000rpm离心5min获得上清液)采用agilent 725es型icp-oes分别测定总的金元素浓度和游离金元素的浓度，并进一步计算不同微生物对金离子的还原效率。
[0098]
结果如图2所示，不同微生物对金离子均具有较好的还原能力，将1mm的氯金酸与这五种微生物共培养24h后，大肠杆菌，产气肠杆菌和丙酮丁醇梭菌对金离子的还原效率均在96％以上，丁酸梭菌和拜式梭菌对金离子的还原效率约在88％左右。
[0099]
实施例3：丁酸梭菌对不同浓度的金离子还原效果
[0100]
将20ml在液体强化梭菌培养基中培养12h的丁酸梭菌菌液5000rpm离心5min后弃掉上清液，加入20ml无菌的新鲜液体强化梭菌培养基和过滤除菌的氯金酸溶液，使得氯金酸的浓度分别为0.25mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm，密封后在37℃培养箱中静置培养24h后取
含有含金纳米粒子—生物催化剂杂化体的菌液，将含有金纳米粒子的菌液和上清液(将含有金纳米粒子的菌液在5000rpm离心5min获得上清液)采用agilent 725es型icp-oes分别测定总的金元素浓度和游离金元素的浓度，并进一步计算丁酸梭菌对金离子的还原效率。
[0101]
结果如图3所示，随着氯金酸浓度的增加，丁酸梭菌对金离子的还原效率先增加后减小，并且在金离子浓度为0.5mm时，丁酸梭菌对金离子的还原效率最高，约88.36％的金离子被还原，而当金离子浓度增加到2mm时，丁酸梭菌对金离子的还原效率降低到32.43％。因此丁酸梭菌还原金离子生成金纳米粒子体系中，金离子的最佳工作浓度为0.5mm。
[0102]
实施例4：丁酸梭菌还原金离子的反应时间
[0103]
将20ml在液体强化梭菌培养基中培养12h的丁酸梭菌菌液5000rpm离心5min后弃掉上清液，加入20ml无菌的液体强化梭菌培养基或20ml无菌生理盐水和过滤除菌的氯金酸溶液，使得氯金酸的浓度为0.5mm，密封后在37℃培养箱中静置培养，每隔固定时间(6h、12h、24h、36h、48h)取含有自沉淀金纳米粒子的菌液，将含有金纳米粒子的菌液和上清液(5000rpm离心5min获得上清液)采用agilent 725es型icp-oes分别测定总的金元素浓度和游离金元素的浓度，并进一步计算丁酸梭菌对金离子的还原效率。
[0104]
结果如图4所示，在生理盐水和强化梭菌培养基两种溶剂中丁酸梭菌对金离子的还原效率均随还原时间的延长先增加后不变，反应平衡后生理盐水中丁酸梭菌对金离子的还原效率略高于强化梭菌培养基体系，强化梭菌培养基体系中丁酸梭菌还原金离子24h时的金离子还原效率为88％，而在生理盐水体系中相同还原时间时丁酸梭菌对金离子的还原效率增加至96.06％，继续延长反应时间至48h，丁酸梭菌对金离子的还原效率不再明显增加，因此丁酸梭菌对金离子的还原时间为6～48h，优选24h。
[0105]
实施例5：金纳米粒子与丁酸梭菌混合体系厌氧光发酵产氢。
[0106]
在100ml液体强化梭菌培养基的严格厌氧光生物发酵体系中，的厌氧光生物发酵体系中，补充葡萄糖(工作浓度为10g/l)和半胱氨酸(工作浓度为1.5g/l)分别作为碳源和外源电子供体。在发酵体系中接种实施例1中在强化梭菌培养基中以0.5mm氯金酸为前体制备的含有丁酸梭菌还原金纳米粒子的杂化体(菌体沉淀离心弃掉上清液，加入新鲜的液体强化梭菌培养基到原体积)，接种量为发酵体系的10％(体积分数，od600＝0.220)。将光生物发酵制氢系统置于37℃的光照培养箱中，在led白光灯(2.5mw/cm2)下进行光生物发酵培养(120rpm)，设置采用锡纸包裹的暗发酵体系作为对照。培养2h后将制氢系统连接到气囊并每隔固定时间收集气体，采用排水法测定发酵产生的生物气的总体积，并进一步采用气相色谱(tcd检测器，岛津)测定生物气中所含氢气的浓度，以计算发酵所产生的氢气总量。
[0107]
如图5所示，丁酸梭菌暗发酵144h时的累积氢气产量为1289.49ml/l，丁酸梭菌光发酵的累积氢气产量增加到了1417.11ml/l。而丁酸梭菌还原金离子生成的金纳米粒子与丁酸梭菌杂化体的暗发酵和光发酵的氢气产量均明显高于裸露的丁酸梭菌体系，金纳米粒子与丁酸梭菌光发酵的累积氢气产量相比于裸露丁酸梭菌暗发酵提高了66.5％，达到了2147.40ml/l。表明丁酸梭菌还原金离子生成的金纳米粒子能够促进丁酸梭菌光发酵产氢。因此本发明方法利用丁酸梭菌还原金离子制得的金纳米粒子能够应用于增强丁酸梭菌暗发酵或者光发酵制氢，进一步的，本发明制得的金纳米粒子能够用于增强宿主细胞(合成金纳米粒子的细胞)的光生物催化生产目标物的能力。
[0108]
应当注意的是，以上所述的实施例仅为本发明较佳实施例，用于解释本发明，并不
构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。