一株深绿木霉Ta102、多功能有机肥及其应用

一株深绿木霉ta102、多功能有机肥及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株深绿木霉ta102、多功能有机肥及其应用。


背景技术：

2.有机肥通常以植物和(或)动物残体为主要原料，经过加工使其具备安全的使用条件，用于改良培肥土壤和为植物生长提供养分。有机肥含有较高量的有机质，可增加和更新土壤有机质，促进微生物繁殖，改善土壤的理化性质和生物活性，保持并提高土壤肥力。
3.目前，有机肥生产采用的主要原料为秸秆(据统计研究，主要为作物秸秆)和畜禽粪便(据统计研究，主要为牛粪羊粪)，这些原料均含有大量的木质纤维素。在木质纤维素的构成中，木质素是由三种醇单体组成的芳香族无定形聚合物，作为纤维素和半纤维素交联键之间的胶结材料，木质素的降解是木质纤维素降解过程中的限速因子。木质素的天然降解包括解聚和矿化两个阶段，解聚阶段主要催化断裂木质素结构单元间碳碳键、碳氢键和醚键，矿化阶段主要将解聚阶段产生的芳香族化合物解构为线性形式(赵一全等，2020)。一些微生物具有的漆酶、过氧化物酶等可降解木质素的酶，其中漆酶是目前已知的唯一一种既参与木质素解聚过程，又可进一步利用芳香族化合物参与矿化过程的酶类(李春凤，2010)。高漆酶活性对于木质纤维素快速降解具有重要作用。
4.常见的有机肥发酵剂由具备降解能力的活菌复配并添加载体制得，能够在一定程度上起到提升物料腐熟积温，加速有机肥软化、分解的作用。但是，由于受到菌种组配和环境差异的限制，尤其是对木质素的分解效率较低，导致有机肥发酵腐熟效率不够理想、使用效果不稳定。因此，寻找产生高活性漆酶的菌株对于提高有机肥腐熟效率具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对目前选用的木质素降解菌降解能力差、导致有机肥腐熟效率低的技术问题，本发明提供一株深绿木霉ta102、多功能有机肥及其应用，深绿木霉ta102分离筛选自玉米秸秆-牛粪堆肥漆酶活性峰值期的发酵物，可以高效、稳定生产高活性漆酶，大大提高了有机肥的腐熟效率。
6.第一方面，本发明提供一种深绿木霉ta102，所述深绿木霉(trichoderma atroviride)ta102已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏日期为2022年7月13日，保藏编号为cgmcc no.40242。
7.第二方面，本发明提供一种利用上述深绿木霉ta102生产高活性漆酶、锰过氧化物酶、半纤维素酶、纤维素酶的应用。
8.试验表明，深绿木霉ta102中，高活性漆酶的酶活力为396.50iu/ml，锰过氧化物酶活力为2.96iu/ml，半纤维素酶活力为60.41iu/ml，纤维素酶活力为3.25iu/ml。锰过氧化物酶参与木质素解聚，半纤维素酶参与分解半纤维素和纤维素酶参与分解纤维素，高活性漆酶既参与木质素解聚过程，又参与矿化过程。具备该复合降解酶系的深绿木霉ta102可以高
效制备有机肥，腐熟时间仅需9～12天。
9.第三方面，本发明提供一种利用上述深绿木霉ta102生产吲哚乙酸的应用。试验表明，深绿木霉ta102的吲哚乙酸的产生水平为153.42μg/l。
10.第四方面，本发明提供一种利用上述深绿木霉ta102抑制立枯丝核菌、尖孢镰刀菌或串珠镰刀菌的应用。
11.深绿木霉ta102对立枯丝核菌的抑菌率为100.00％
±
0.00％，对尖孢镰刀菌的抑菌率为100.00％
±
0.00％，对串珠镰刀菌的抑菌率为75.85％
±
4.62％。
12.第五方面，本发明提供一种利用上述深绿木霉ta102发酵制备有机肥的应用。
13.第六方面，本发明提供一种多功能有机肥，以重量份数计，原料包括深绿木霉ta102可湿性粉剂0.1～0.5份，牛粪100～150份，粉碎玉米秸秆30～40份，其中深绿木霉ta102可湿性粉剂的有效活菌数≥8
×
109cfu/g；
14.制备方法为控制水料比为1:(0.7
±
0.05)，初始ph值为6
±
0.5，常温下堆积发酵9～12天，每隔3天翻堆一次，发酵完成后进行干燥粉碎即可。
15.进一步的，深绿木霉ta102可湿性粉剂按照如下制备方法制得：
16.(1)种子液的制备：将-80℃保藏的深绿木霉ta102接种于pda平板，26～30℃活化3天，在菌落边缘取菌丝接种于pda平板中，26～30℃培养3天，重复取菌丝培养一次，得到活化的菌株；将活化好的菌株在pda平板上26～30℃、12h光照-12h黑暗条件下培养7～12天，制备107个/ml的分生孢子悬浊液，以1:100体积比接种于pdb培养液，26℃、180rpm条件下震荡培养48～72小时，得到种子液，种子液的活菌数1
×
105～9
×
105cfu/ml；；
17.(2)深绿木霉ta102菌粉的制备：种子液以体积百分比15％～25％接入装有液体发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵温度在12小时之前为27～33℃、12小时之后为25～30℃，初始ph为4.0～5.0，搅拌速度为200～300rpm，通气量为10～15l/min，发酵时间为72～96小时；发酵产物中活菌数为1
×
109～8
×
109cfu/ml；将发酵液经真空冷冻干燥，得到深绿木霉ta102菌粉，其活菌数≥2
×
10
10
cfu/g；
18.(3)深绿木霉ta102可湿性粉剂的制备：将深绿木霉ta102菌粉与助剂按照以下重量份数混合：深绿木霉ta102菌粉50～70份，硅藻土40～60份，润湿剂3～5份，分散剂4～6份，粘着剂0.3～0.6份，硫酸锌1.5～2.5份，混匀制得深绿木霉ta102可湿性粉剂。
19.进一步的，步骤(2)中，液体发酵培养基包括下述重量份数的组分：爆破玉米秸秆粉70～200份，爆破蔬菜秸秆粉40～80份，麦麸粉45～65份，葡萄糖15～40份，(nh4)2so
4 1～1.5份，kh2po
4 0.03～0.05份，mgso4·
7h2o 0.04～0.06份，水6000～8000份。
20.第七方面，本发明提供一种施用上述多功能有机肥抑制草莓丝核菌根腐病、草莓镰刀菌根腐病、番茄立枯病和/或番茄枯萎病的应用。
21.第八方面，本发明提供一种施用上述多功能有机肥促进草莓或番茄生长的应用。
22.本发明的有益效果在于：
23.1、本发明提供的一株深绿木霉ta102具备高活性漆酶和复合降解酶系，可以使有机肥制备腐熟时间缩短到9～12天。
24.2、本发明提供的深绿木霉ta102可以抑制立枯丝核菌、尖孢镰刀菌或串珠镰刀菌，还可产生153.42μg/l吲哚乙酸，利用该深绿木霉ta102发酵制备的有机肥同时具有抑制立枯病、根腐病等土传病害和促生的功能。
25.3、本发明提供的利用深绿木霉ta102制备多功能有机肥的工艺，与多菌株构建的复合菌系相比，对发酵条件要求较低，有助于简化有机肥制备工艺，降低成本。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1是本发明实施例1中ta102的菌落状态图。
28.图2是本发明实施例2中平板筛选结果图。
29.图中，a为菌落正面图，b为菌落反面图，c为愈创木酚平板筛选结果图，d为苯胺蓝平板筛选结果图，e为cmc平板筛选结果图，f为木聚糖平板筛选结果图。
具体实施方式
30.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
31.实施例1菌株的分离与鉴定
32.(1)菌株来源：玉米秸秆-牛粪堆肥漆酶活性峰值期的发酵物，2020年5月采集于山东济南堆肥场。
33.(2)菌株分离：将采集的发酵物样本用含有0.3％吐温-80的无菌水梯度稀释至10-1
～10-7
倍，从每个梯度稀释液中分别取100μl涂布玫瑰红钠琼脂培养基平板，在28℃恒温培养3天。从每个梯度稀释的平板中挑取单菌落进行鉴定。
34.(3)通过形态学显微镜观察和内源转录间隔区(internally transcribed spacer，its)比对，鉴定种属。其中，编号为ta102的菌株为分离得到的优势菌株。
35.ta102的菌落状态见图1，ta102的its基因序列为：
36.gcttaagttcagcgggtattcctacctgatccgaggtcaacatttcagaagttgggtgttttacggacgtggacgcgccgcgctcccggtgcgagttgtgcaaactactgcgcaggagaggctgcggcgagaccgccactgtatttcggggccgggatcccgtcttaggggctcccgaggtccccaacgccgaccccccggaggggttcgagggttgaaatgacgctcggacaggcatgcccgccagaatactggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgattcattttgaatttttgctcagagctgtaagaaataacgtccgcgaggggactacagaaaagagtttggttggtccctccggcgggcgcctggttccggggctgcgacgcacccggggcgtgaccccgccgaggcaacagtttggtatggttcacattgggtttgggagttgtaaactcggtaatgatccctccgctggttcaccaacggagaccttgt。
37.经鉴定，编号为ta102的菌株为深绿木霉(trichoderma atroviride)，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏日期为2022年7月13日，保藏编号为cgmcc no.40242。
38.实施例2深绿木霉ta102的降解酶酶活定性分析鉴定
39.(1)取实施例1分离获得的优势菌株深绿木霉ta102，在pda平板上26℃恒温培养3天；
40.(2)采用平板进行木质纤维素降解酶的定性检测，过程如下：
41.①
愈创木酚平板筛选产漆酶的菌株
42.a.制备愈创木酚平板：将愈创木酚单独过滤除菌制成1％的母液(25倍)，无菌条件下以0.01％体积浓度加入含0.1g/l cuso4的pda培养基中，倒平板冷却制得。
43.b.用无菌打孔器取pda平板上培养好的菌落，接种于愈创木酚平板上，制备3个平板重复，在27
±
1℃条件下倒置培养，记录在愈创木酚平板上有无砖红色色素产生现象，产砖红色者记为+，反之记为-。根据产色素区域直径，选出产漆酶能力强的菌株，并记录时间。
44.经培养，深绿木霉ta102在愈创木酚平板培养基中可产生明显砖红色色素，第4天产色素直径为9cm(充满平板)，见图2中c图。
45.②
苯胺蓝平板筛选产锰过氧化物酶的菌株
46.a.制备苯胺蓝平板：将rb亮蓝单独过滤除菌制成2％的母液(200倍)，无菌条件下以0.01％体积浓度加入含0.1g/l cuso4的pda培养基中，倒平板冷却制得。
47.b.用无菌打孔器取pda平板上培养好的菌落，接种于苯胺蓝平板上，制备3个平板重复，在27
±
1℃条件下倒置培养，记录在苯胺蓝平板上有无脱色透明现象，脱色者记为+，反之记为-。根据透明区域直径，选出产锰过氧化物酶能力强的菌株，并记录时间。
48.经培养，深绿木霉ta102在苯胺蓝平板培养基中可使染料脱色透明，第4天透明区域直径为4.04cm，见图2中d图。
49.③
cmc平板筛选产纤维素酶的菌株：
50.a.cmc平板培养基：cmc 10g，(nh4)2so
4 4g，kh2po
4 2g，mgso4·
7h2o 0.5g，蛋白胨1.0g，琼脂16g，去氧胆酸钠0.5g，蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌20min。
51.b.用无菌打孔器取pda平板上培养好的菌落，接种于cmc平板上，制备3个平板重复，在27
±
1℃条件下倒置培养4天，然后用0.1％的刚果红染液覆盖平板，静置30min，再用1mol/lnacl脱色1h，观察各菌株是否产生水解透明圈。根据水解透明圈的直径，选出产纤维素酶能力强的菌株。
52.经培养，深绿木霉ta102在cmc培养基中可产生水解透明圈，第4天透明圈直径为3.09cm，见图2中e图。
53.④
木聚糖平板筛选产半纤维素酶的菌株
54.a.木聚糖平板培养基：(nh4)2so
4 2g，mgso4·
7h2o 0.5g，kh2po
4 1g，nacl 0.5g，木聚糖2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph值自然，121℃高压灭菌20min。
55.b.用无菌打孔器取pda平板上培养好的菌落，接种于木聚糖平板上，制备3个平板重复，在25
±
1℃条件下倒置培养4天；然后用0.1％的刚果红染液覆盖平板，静置10min，再用2mol/l nacl脱色2～3次，观察各菌株是否产生水解透明圈。根据水解透明圈的直径，选出产半纤维素酶能力强的菌株。
56.经培养，深绿木霉ta102在木聚糖培养基中可产生水解透明圈，第4天透明圈直径为6.24cm，见图2中f图。
57.经过平板筛选可知，深绿木霉ta102具有漆酶、锰过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶四种酶。
58.实施例3深绿木霉ta102的降解酶酶活定量检测
59.①
漆酶活力检测：在pda平板上活化ta102菌株，制备1
×
107个/ml的分生孢子悬浊液，在27
±
1℃、160rpm条件下培养5天，获得发酵液；将发酵液在4℃、12000rpm离心20min，上清为粗酶液。
60.取0.7ml粗酶液加入0.7ml abts缓冲液(3mmol/l abts，0.1mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液ph＝4.5)启动反应，在420nm波长下测定l0min内的吸光值变化。定义每分钟转化lμmol abts所需的酶量为一个活力单位。设置三个重复。经检测，深绿木霉ta102的漆酶活力为396.50iu/ml，
61.②
锰过氧化物酶活力检测：在pda平板上活化ta102菌株，制备1
×
107个/ml的分生孢子悬浊液，按体积比1％接种于藜芦醇培养液中，在26
±
1℃、160rpm条件下培养5天，获得发酵液；将发酵液在4℃、12000rpm离心20min，上清为粗酶液。
62.将待测粗酶液400μl、50mmol/l乳酸钠缓冲液3.4ml和1.6mmol/l硫酸锰溶液0.1ml混合成反应液，于37℃水浴预热，然后加入1.6mmol/l h2o2溶液0.1ml启动反应，迅速测定240nm处的吸光度，4min后再测定1次。
63.1min内使1μmol/l的mn
2+
转化为mn
3+
为1个酶活单位。以灭菌发酵液为对照，设置三个重复。经检测，深绿木霉ta102的锰过氧化物酶活力为2.96iu/ml。
64.③
纤维素酶活力检测：在pda平板上活化ta102菌株，制备1
×
107个/ml的分生孢子悬浊液，按体积比1％接种于cmc培养液(cmc固体培养基减掉琼脂即得)中，在26
±
1℃、160rpm条件下培养7天，得发酵液。发酵液在4℃、12000rpm离心10min，上清为粗酶液。向2ml eppendorf管中加入含有1％(w/v)cmc的柠檬酸-na2hpo4缓冲液(ph＝4.5)400μl，50℃水浴锅中预热3min后，加入粗酶液100μl，保温30min后加入1ml dns试剂终止反应，充分摇匀后沸水浴5min，冷水冷却后测定其在540nm波长下的吸光度。以灭菌的发酵液为对照。设置三个重复。经检测，深绿木霉ta102的纤维素酶活力为3.25iu/ml。
65.④
半纤维素酶活力检测：在pda平板上活化深绿木霉ta102，制备1
×
107个/ml的分生孢子悬浊液，按体积比1％接种于木聚糖培养液(木聚糖固体培养基减掉琼脂即得)中，在26
±
1℃、160rpm条件下培养7天，得发酵液。吸取稀释20倍的发酵液0.5ml，加到磷酸氢二钠-柠檬缓冲液(ph＝4.8)配制的1％木聚糖溶液中，50℃酶解30min。酶解后加入3ml dns试剂，沸水浴中加热5min，然后用冰水迅速冷却，补加蒸馏水至25ml，测定540nm处吸光度，设置三个生物学重复，以灭菌的发酵液为对照，按照下面的公式计算：
[0066][0067]
式中：w为酶解生成木糖的含量，mg；
[0068]
n为发酵液的稀释倍数；
[0069]
30为酶解时间，min；
[0070]
v为反应液体积，ml。
[0071]
经检测，深绿木霉ta102的半纤维素酶活力为60.41iu/ml。
[0072]
⑤
吲哚乙酸含量测定：在pda平板上活化ta102菌株，制备1
×
107个/ml的分生孢子悬浊液，在27
±
1℃、160rpm条件下培养5天，获得发酵液；将发酵液在4℃、12000rpm离心20min，取上清液。利用gc-ms检测发酵上清液中的吲哚乙酸含量。经检测，深绿木霉ta102的
吲哚乙酸产量为153.42μg/l。
[0073]
实施例4深绿木霉ta102对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌或串珠镰刀菌的拮抗作用
[0074]
将深绿木霉ta102分别与立枯丝核菌、尖孢镰刀菌或串珠镰刀菌共同接入pda平板中，于25℃活化两次，第二次活化生长3天后，从菌落边缘用5mm打孔器打菌饼。将深绿木霉ta102与立枯丝核菌置于同一9cm pda平板的中心线两端，记平板编号a；将深绿木霉ta102与尖孢镰刀菌置于同一9cm pda平板的中心线两端，记平板编号b；将深绿木霉ta102与串珠镰刀菌置于同一9cm pda平板的中心线两端，记平板编号c；将编号a、编号b和编号c的平板均于25℃培养6～8天，测量ta102生长前端至病原菌饼的距离t(单位：cm)。以三种病原菌单独培养的平板为对照，对照测量病原菌生长前端至病原菌饼的距离c(单位：cm)。每个平板设5个生物学重复，抑菌率计算公式如下：
[0075][0076]
由测量结果计算得，深绿木霉ta102对立枯丝核菌的抑菌率100.00％
±
0.00％，对尖孢镰刀菌的抑菌率为100.00％
±
0.00％，对串珠镰刀菌的抑菌率为75.85％
±
4.62％。结果表明，深绿木霉ta102对上述三种病原菌有显著的拮抗作用。
[0077]
实施例6深绿木霉ta102菌剂和多功能有机肥的制备
[0078]
(1)种子液的制备：将-80℃保藏的深绿木霉ta102接种于pda平板，26℃活化3天，在菌落边缘取菌丝接种于pda平板中，26℃培养3天，重复取菌丝培养一次，得到活化的菌株；将活化好的菌株在pda平板上26℃、12h光照-12h黑暗条件下培养7天，制备107个/ml的分生孢子悬浊液，以1:100体积比接种于pdb培养液，26℃、180rpm条件下震荡培养48小时，得到种子液，种子液的活菌数1
×
105cfu/ml；；
[0079]
(2)深绿木霉ta102菌粉的制备：
[0080]
a.制备液体发酵培养基，包括下述重量份数的组分：爆破玉米秸秆粉70份，爆破蔬菜秸秆粉40份，麦麸粉45份，葡萄糖15份，(nh4)2so
4 1份，kh2po
4 0.03份，mgso4·
7h2o0.04份，水6000份。
[0081]
b.种子液以体积百分比15％接入装有液体发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵温度在12小时之前为27℃、12小时之后为25℃，初始ph为4.0，搅拌速度为200rpm，通气量为10l/min，发酵时间为72小时；发酵产物中活菌数为1
×
109cfu/ml；将发酵液经真空冷冻干燥，得到深绿木霉ta102菌粉，其活菌数≥2
×
10
10
cfu/g；
[0082]
(3)深绿木霉ta102可湿性粉剂的制备：将深绿木霉ta102菌粉与助剂按照以下重量份数混合：深绿木霉ta102菌粉50份，硅藻土40份，吐温-80 3份，亚甲基二萘磺酸钠4份，淀粉糊0.5份，硫酸锌1.5份，混匀制得深绿木霉ta102可湿性粉剂，其有效活菌数≥8
×
109cfu/g。
[0083]
(4)多功能有机肥的制备：将原料按照以下重量份充分混合：深绿木霉ta102可湿性粉剂0.1份，牛粪100份，粉碎玉米秸秆30份，水料比为1:0.7，初始ph为6，常温下堆积发酵12天，每隔3天翻堆一次，发酵完成后进行干燥粉碎即可。
[0084]
实施例7深绿木霉ta102菌剂和多功能有机肥的制备
[0085]
(1)种子液的制备：将-80℃保藏的深绿木霉ta102接种于pda平板，30℃活化3天，在菌落边缘取菌丝接种于pda平板中，230℃培养3天，重复取菌丝培养一次，得到活化的菌
株；将活化好的菌株在pda平板上30℃、12h光照-12h黑暗条件下培养12天，制备1
×
107个/ml的分生孢子悬浊液，以1:100体积比接种于pdb培养液，26℃、180rpm条件下震荡培养72小时，得到种子液，种子液的活菌数9
×
105cfu/ml；；
[0086]
(2)深绿木霉ta102菌粉的制备：
[0087]
a.制备液体发酵培养基，包括下述重量份数的组分：爆破玉米秸秆粉200份，爆破蔬菜秸秆粉80份，麦麸粉65份，葡萄糖40份，(nh4)2so
4 1.5份，kh2po
4 0.05份，mgso4·
7h2o0.06份，水8000份。
[0088]
b.种子液以体积百分比25％接入装有液体发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵温度在12小时之前为33℃、12小时之后为30℃，初始ph为5.0，搅拌速度为300rpm，通气量为15l/min，发酵时间为96小时；发酵产物中活菌数为8
×
109cfu/ml；将发酵液经真空冷冻干燥，得到深绿木霉ta102菌粉，其活菌数≥2
×
10
10
cfu/g；
[0089]
(3)深绿木霉ta102可湿性粉剂的制备：将深绿木霉ta102菌粉与助剂按照以下重量份数混合：深绿木霉ta102菌粉70份，硅藻土60份，吐温-80 5份，亚甲基二萘磺酸钠6份，淀粉糊0.6份，硫酸锌2.5份，混匀制得深绿木霉ta102可湿性粉剂，其有效活菌数≥8
×
109cfu/g。
[0090]
(4)多功能有机肥的制备：将原料按照以下重量份充分混合：深绿木霉ta102可湿性粉剂0.5份，牛粪150份，粉碎玉米秸秆40份，控制水料比为1:0.75，初始ph为6
±
0.5，常温下堆积发酵9天，每隔3天翻堆一次，发酵完成后进行干燥粉碎即可。
[0091]
实施例8深绿木霉ta102菌剂和多功能有机肥的制备
[0092]
(1)种子液的制备：将-80℃保藏的深绿木霉ta102接种于pda平板，28℃活化3天，在菌落边缘取菌丝接种于pda平板中，28℃培养3天，重复取菌丝培养一次，得到活化的菌株；将活化好的菌株在pda平板上28℃、12h光照-12h黑暗条件下培养9天，制备107个/ml的分生孢子悬浊液，以1:100体积比接种于pdb培养液，26℃、180rpm条件下震荡培养48～72小时，得到种子液，种子液的活菌数5
×
105cfu/ml；；
[0093]
(2)深绿木霉ta102菌粉的制备：
[0094]
a.制备液体发酵培养基，包括下述重量份数的组分：爆破玉米秸秆粉100份，爆破蔬菜秸秆粉60份，麦麸粉50份，葡萄糖25份，(nh4)2so
4 1.2份，kh2po
4 0.04份，mgso4·
7h2o0.05份，水7000份。
[0095]
b.种子液以体积百分比20％接入装有液体发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵温度在12小时之前为30℃、12小时之后为27℃，初始ph为5.0，搅拌速度为250rpm，通气量为12l/min，发酵时间为85小时；发酵产物中活菌数为5
×
109cfu/ml；将发酵液经真空冷冻干燥，得到深绿木霉ta102菌粉，其活菌数≥2
×
10
10
cfu/g；
[0096]
(3)深绿木霉ta102可湿性粉剂的制备：将深绿木霉ta102菌粉与助剂按照以下重量份数混合：深绿木霉ta102菌粉60份，硅藻土50份，吐温-80 4份，亚甲基二萘磺酸钠5份，淀粉糊0.5份，硫酸锌2份，混匀制得深绿木霉ta102可湿性粉剂，其有效活菌数≥8
×
109cfu/g。
[0097]
(4)多功能有机肥的制备：将原料按照以下重量份充分混合：深绿木霉ta102可湿性粉剂0.3份，牛粪120份，粉碎玉米秸秆35份，控制水料比为1:0.7，初始ph为6
±
0.5，常温下堆积发酵10天，每隔3天翻堆一次，发酵完成后进行干燥粉碎即可。
[0098]
实施例9多功能有机肥应用于草莓种植的田间试验
[0099]
(1)试验地点：山东省济南市历城区草莓温室大棚，供试草莓品种为红颜。
[0100]
(2)试验内容：
[0101]
①
设置多个小区，每个小区面积为10m2，小区之间间隔保护行。
[0102]
②
将小区随机分为四组，分别为处理组、对照组1、对照组2和空白对照组，每组五个小区，具体处理如下：
[0103]
处理组：施用的有机肥为实施例6制备的多功能有机肥；
[0104]
对照组1：施用的有机肥为采用实施例6相同方法制备的有机肥，但制备过程不添加深绿木霉ta102菌剂；
[0105]
对照组2：施用的有机肥为采用实施例6相同方法制备的有机肥，但制备过程中将深绿木霉ta102菌剂置换为商品腐熟发酵剂(活性成分为：枯草芽孢杆菌+酿酒酵母+长枝木霉，活菌总数》2
×
109cfu/g)。
[0106]
空白对照组：不施加有机肥。
[0107]
处理组和对照组1、对照组2在草莓种植中的肥料施用方式均为统一操作，且为常规施用方式，即定植前施入400kg/亩、花期前施入20kg/亩、果期施入40kg/亩。
[0108]
③
结果统计与分析：
[0109]
a.在草莓苗期，各处理分别随机取10株植株测定壮苗指数和亩产量。
[0110]
其中，
[0111][0112]
b.在草莓收获期，对草莓病害情况进行调查，各处理分别统计计算防治效果，公式如下：
[0113][0114][0115]
其中，病情指数i为空白对照组的病情指数，病情指数ii指为处理组或对照组1或对照组2的病情指数。
[0116]
其中，草莓丝核菌根腐病(由立枯丝核菌引起)病情分级参考《农作物主要病虫害预测预报与防治》，草莓镰刀菌根腐病(由尖孢镰刀菌引起)病情分级参考《ny/t1464.16-2007农药田间药效试验准则》。
[0117]
各项结果如表1所示：
[0118]
表1多功能有机肥应用于草莓种植效果
[0119][0120]
注：字母不一致代表有显著差异(p《0.05)。
[0121]
利用本发明的深绿木霉ta102制备的多功能有机肥(处理组)在壮苗指数、产量和对草莓丝核菌根腐病和镰刀菌根腐病的防治效果上都显著高于各对照组，表明该多功能有机肥具有优异的草莓丝核菌根腐病、草莓镰刀菌根腐病抑制功能和促进草莓生长功能。
[0122]
实施例10多功能有机肥应用于番茄种植的田间试验
[0123]
(1)试验地点：山东省济南市历城区番茄温室大棚，供试番茄品种为粉果番茄。
[0124]
(2)试验内容：
[0125]
①
设置多个小区，每个小区面积为10m2，小区之间间隔保护行，各处理小区间随机排列。
[0126]
②
将小区分为四组，分别为处理组、对照组1、对照组2和空白对照组，每组五个小区，具体处理如下：
[0127]
处理组：施用的有机肥为实施例7制备的多功能有机肥；
[0128]
对照组1：施用的有机肥为采用实施例7相同方法制备的有机肥，但制备过程不添加深绿木霉ta102菌剂；
[0129]
对照组2：施用的有机肥为采用实施例7相同方法制备的有机肥，但制备过程中将深绿木霉ta102菌剂置换为商品腐熟发酵剂(活性成分为：枯草芽孢杆菌+酿酒酵母+长枝木霉，活菌总数》2
×
109cfu/g)
[0130]
空白对照组：不施加有机肥。
[0131]
处理组和对照组1、对照组2在番茄种植中的肥料施用方式均为统一操作，且为常规施用方式，即定植前施入500kg/亩。
[0132]
③
结果统计与分析：
[0133]
a.在番茄苗期，各处理分别随机取10株植株测定壮苗指数和亩产量。
[0134]
其中，
[0135]
b.在番茄收获期，对番茄病害情况进行调查，各处理分别统计计算防治效果，公式如下：
[0136]
[0137][0138]
其中，病情指数i为空白对照组的病情指数，病情指数ii指为处理组或对照组1或对照组2的病情指数。
[0139]
其中，番茄立枯病(由立枯丝核菌引起)病情分级参考《农作物主要病虫害预测预报与防治》，番茄枯萎病(由尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌引起)病情分级参考《ny/t1464.16-2007农药田间药效试验准则》。
[0140]
各项结果如表2所示：
[0141]
表2多功能有机肥应用于番茄种植效果
[0142][0143]
注：字母不一致代表有显著差异(p《0.05)。
[0144]
利用本发明的深绿木霉ta102制备的多功能有机肥(处理组)在壮苗指数和对番茄立枯病、番茄枯萎病的防治效果上都显著高于各对照组，在产量上显著高于空白对照组和对照组1，比施用商品腐熟发酵组的对照组2有所提高但未达显著。
[0145]
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。