抗多房棘球绦虫的纳米抗体EmCN4及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及抗多房棘球绦虫的纳米抗体emcn4及其制备方法和应用。

背景技术：

1、包虫病或称棘球蚴病(echinococciosis)，是人感染棘球绦虫的幼虫(棘球蚴)所致的慢性寄生虫病，由带科棘球属绦虫感染引起故又称棘球蚴病，其主要分为囊型包虫病(cticechinococcosis；ce)和泡型包虫病(alveolar echinocococosis；ae)，分别为细粒棘球蚴(echinococus granulosus；e.g.)和多房棘球蚴(echinocococus multilocularis；e.m.)感染所致。其中多房棘球绦虫的中间宿主为黄鼠、田鼠、沙鼠、小家鼠和人。人泡型包虫病通常比细粒棘球蚴病更严重，病死率较高。泡型包虫病几乎100％原发于肝脏，肺、脑等其它部位的继发感染多由肝通过血循环转移而来。由于多房棘球蚴在肝实质内呈弥漫性浸润生长，并逐渐波及到整个肝，对肝组织的破坏非常严重，可引起肝功能衰竭而导致昏迷，或诱发肝硬化而引起门静脉高压，并发消化道大出血而致死亡。狐、犬为多房棘球绦虫的终末宿主，在终宿主体内大约45天发育为成虫。长期以来，包虫病被认为是一种人畜共患的寄生虫病，称之为动物源性疾病，近年来流行病学调查表明，在流行区带有职业性损害的特点，被列为某些人群的职业病，称之地方性寄生虫病；从全球范围讲，包虫病为少数民族或宗教部落所特有的一种常见病和多发病。

2、目前对于终末宿主的诊断尚无活体检测的有效方法，现有终末宿主的诊断还是依赖于犬粪便虫卵及动物剖检进行诊断，由于绦虫属虫卵形态相似等因素导致目前尚无有效的方法对终末宿主的感染进行诊断；针对中间宿主的诊断目前主要以血清学指标及ct或超声进行诊断，对于一些小病灶会出现漏检。因此对于终末宿主犬的快速、特异性诊断及中间宿主精确诊断方法的建立对该疾病的防控具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供抗多房棘球绦虫的纳米抗体emcn4及其制备方法和应用，所述纳米抗体emcn4可用于多房棘球绦虫幼虫时期囊泡的示踪定位、中间宿主感染后病灶示踪和分离多房棘球绦虫幼虫时期的生发细胞。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了抗多房棘球绦虫的纳米抗体emcn4，所述纳米抗体emcn4的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体如下：

4、qlqlvesggglvqpggslrlscaasgfslddyaigwfrqapgkereg vscisssggstnyadsvkgrftisrdnakntvylrmfn。

5、本发明提供了表达纳米抗体emcn4的基因，所述纳米抗体emcn4的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体如下：

6、ccctcgtagtgcacattcctttaacgcttcaaaatctgtaaagcacgccatatcgccgaaaggcacacttaattattaagaggtaatacaccatgaatcacaaagtgcatcatcatcatcatcatatgcaactgcagctggtagaatctggtggtggtctggtacaaccaggtggttctctgcgtctgagctgcgctgcatctggcttctctctggacgactacgctattggttggttccgtcaggccccgggtaaagaacgcgaaggcgtgtcttgtatctcctcttccggcggttccaccaactacgcagattccgttaaaggtcgtttcaccatcagccgcgacaacgctaaaaataccgtctacctgcgtatgttcaacctcgagccctcgtagtgcacattcctttaacgcttcaaaatctgtaaagcacgccatatcgccgaaaggcacacttaattattaagaggtaatacaccatgaatcacaaagtgcatcatcatcatcat。

7、本发明提供了上述抗多房棘球绦虫的纳米抗体emcn4的制备方法，包括以下步骤：

8、(1)构建过表达emcn4基因的表达载体pet28a-emcn4；

9、(2)将表达载体转入工程菌株中；

10、(3)经过iptg诱导表达和his-tag蛋白纯化磁珠纯化得到纳米抗体emcn4。

11、进一步地，步骤(1)中所述过表达emcn4基因的表达载体包括初始表达载体pet28a和emcn4基因。

12、进一步地，步骤(1)中所述过表达emcn4基因的表达载体的构建方法包括以下步骤：

13、线性化初始表达载体pet28a；

14、将emcn4基因插入线性化初始表达载体pet28a中得到过表达emcn4基因的表达载体pet28a-emcn4。

15、进一步地，步骤(2)中工程菌为大肠杆菌b1-21。

16、本发明还提供了抗多房棘球绦虫的纳米抗体emcn4在制备多房棘球绦虫中间宿主感染后病灶示踪试剂中的应用。

17、本发明还提供了抗多房棘球绦虫的纳米抗体emcn4在分离多房棘球绦虫幼虫时期生发细胞中的应用。

18、本发明还提供了抗多房棘球绦虫的纳米抗体emcn4在制备治疗泡型包虫病试剂中的应用。

19、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

20、本发明通过噬菌体展示文库筛选出针对多房棘球绦虫高亲和力噬菌体，此方法筛选出的纳米抗体较目前公开的多房棘球绦虫抗体分子量较小，免疫原性更低，特异性更高，具有高水溶性、高稳定性、高抗原结合性和较强的组织穿透力，容易制造和表达，比多克隆抗体更容易廉价批量生产，可以大规模生产，产量很高。此外，其在高达80℃的温度下仍能发挥作用，且在极端的ph值下也很稳定。由于其结构中缺少轻链，使其具有低免疫原性，具有耐热性、展开可逆性、蛋白水解性和高溶解性。现有技术中单克隆抗体目前用于多种癌症的治疗，然而，它们分子量非常大，携带四个多肽链，限制了它们接近目标肿瘤。纳米抗体提供了一个更小的(传统抗体的十分之一大小)、高度稳定的抗体替代品。

21、本发明筛选出的纳米抗体可用于中间宿主感染后病灶示踪、生发细胞的分离和终末宿主虫卵的检测，目前尚无有效的方法对终末宿主活体的感染进行诊断的方法，而本发明筛选出的纳米抗体可以快速、特异性检测终末宿主体内是否携带多房棘球绦虫。本发明纳米抗体还可辅助影像诊断，其分子量小，可准确到达靶部位，可以作为造影剂，携带多房棘球绦虫特异性抗体，辅助诊断。本发明纳米抗体除了作为虫卵检测和影像诊断抗体具有天然优势外，作为治疗抗体也有独特优势，例如纳米抗体用于肿瘤治疗时它比常规抗体更容易穿透至肿瘤核心，更方便完整的评估原发灶和转移灶靶点表达水平、耐药分子表水平、微环境抑制性免疫细胞数量等。纳米抗体药物可深层快速在组织中渗透，快速从血液中清除，可提高药效、减少用量、降低副作用。

22、本发明提供的多房棘球绦虫纳米抗体对其幼虫、囊泡、生发细胞等均具有很高的亲和活性，活体示踪能在1小时内聚集在囊泡周围达到示踪效果，且其分子量小、稳定性好比单克隆抗体更易保存，因此emcn4在应用中显示出优异的结合效果。