从佐夫色绿藻中提取角黄素的工艺及优化方法

本发明涉及生物提取领域，具体涉及从佐夫色绿藻中提取角黄素的工艺及优化方法。

背景技术：

1、佐夫色绿藻(chromochloris zofingiensis)是一种重要的淡水绿藻，因其生长速度较快、生物密度大、可以量化的投入大生产等特点受到广泛关注。研究表明富含佐夫色绿藻富含类胡萝卜素类化合物，其中角黄素的含量最高。角黄素是一种极具潜力的色素和抗氧化剂，其淬灭活性氧和清除自由基能力仅次于虾青素角黄素，是β-胡萝卜素的近两倍，是维生素的五十倍，又称作超级维生素。角黄素同样具有保护皮肤健康及骨骼健康、提高免疫力、抗癌等重要的生理作用。

2、目前，已报道的从微藻中提取类胡萝卜素的方法主要有索氏提取法、有机溶剂提取、酶辅助提取、微波辅助萃取等。由于佐夫色绿藻具有致密且坚硬的三层细胞壁结构导致了高价值的角黄素难以从细胞中释放，增加了提取难度。s.a.choi等人利用强酸(hcl)结合丙酮提取可以有效破坏微藻细胞壁，使类胡萝卜素提取效率高达到85％以上。但是使用大量的强酸和有机溶剂会严重污染环境且容易破坏色素结构。

3、为了进一步克服这些缺陷，研究者寻找到了一种被称为离子液体(il)的新型绿色溶剂，能够对雨生红球藻、球等鞭金藻、富油新绿藻等微藻进行十分有效的破壁提取。在2011年choi等人进一步提出了天然低共熔溶剂(nadess)的概念，即用一些植物来源的初级代谢产物形成类似离子液体的低温共融状态。该溶剂相比之下更为绿色、环保，制备方法更简单、产品纯度高，制备过程无三废，弥补了离子液体毒性大、制备繁琐、提纯困难等诸多不足。大量研究表明nadess对食品、植物中的多酚、黄酮等成分均具有较好的提取效果。前期有研究者分别利用不同种的nadess成功从雨生红球藻和虾壳中高效提取出了虾青素。另一方面，研究证实超声的空化作用、机械效应、热效应能有效破坏细胞壁，利于成分的快速释放与溶解，能够很好的弥补nadess黏度相对较大、提取过程中目标成分扩散慢的不足。但现有公开的提取方法针对佐夫色绿藻中角黄素的提取效果依然存在并不理想的问题。

技术实现思路

1、本发明要解决第一个技术问题在于，克服在现有的微藻破壁提取过程中存在的有机试剂环境污染严重，提取手段能量消耗大，提取效果并不理想等方面的缺陷，采用超声波辅助nades技术筛选出提取佐夫色绿藻中角黄素的最佳nades配方。从而提供一种安全绿色、提取效率更高的利用天然低共熔溶剂从佐夫色绿藻中提取角黄素的方法。

2、本发明要解决第二个技术问题在于，现有技术中对于天然低共熔溶剂的提取参数筛选需要进行大量的实验，导致工艺条件筛选耗时长且浪费实验耗材的问题；本发明利用部分因子设计分析和响应曲面分析优化出最佳的提取条件，为佐夫色绿藻的绿色环保破壁提取工艺新技术的开发奠定了基础。进而提供一种可以预测最佳工艺条件的方法，以达到无需大量实验也能获取最佳工艺条件的优化天然低共熔溶剂从佐夫色绿藻中提取角黄素工艺条件的方法。

3、优化天然低共熔溶剂提取角黄素的工艺条件的方法，包括：

4、利用天然低共熔溶剂从佐夫色绿藻中提取角黄素，选择提取效率最优的天然低共熔溶剂种类；

5、以效率最优的天然低共熔溶剂的摩尔比a、佐夫色绿藻与天然低共熔溶剂的固液比b、超声时间c、超声温度d为考察因素进行部分因子设计实验，获得不同参数下角黄素提取效率y1；

6、所述选择提取效率最优的天然低共熔溶剂种类由辛酸和癸酸组成。

7、所述辛酸与癸酸摩尔比a的范围为1:1-3:1、固液比b的范围为30-70mg/ml、超声时间c的范围为25-60min、超声温度d的范围为35-65℃。

8、根据角黄素提取效率y1运用软件进行二次回归分析，获得角黄素提取效率y1与摩尔比a、固液比b、超声时间c、超声温度d之间的回归方程及方差分析表，最终确认p＜0.05的对提取效率影响最显著的考察因素，即主效应因子；

9、所述最终确认p＜0.05的对提取效率影响最显著的考察因素(主效应因子)分别为辛酸与癸酸摩尔比a、固液比b、超声时间c。

10、将影响最为显著的考察因素用于中心复合设计实验，获取影响最为显著的考察因素在不同工艺条件下的角黄素提取效率y2；根据角黄素提取效率y2运用软件进行二次回归分析，获得角黄素提取效率y2与影响最显著的考察因素之间的回归方程；

11、利用二次回归分析获得的回归方程预测最佳工艺条件。

12、利用不同种类的天然低共熔溶剂从佐夫色绿藻中提取角黄素的过程包括：

13、制备不同种类的天然低共熔溶剂；

14、将佐夫色绿藻粉与天然低共熔溶剂进行混合，并超声获得提取液；

15、离心后获得提取样品。

16、所述不同种类的天然低共熔溶剂由氯化胆碱、1，3-丁二醇、1，2-丙二醇、1，4-丁二醇、1，3-丙二醇、乙二醇、甘油、d，l-苹果酸、癸酸、辛酸、月桂酸、壬酸、d，l-薄荷醇、d，l-乳酸中的两种组成；

17、和/或，所述佐夫色绿藻粉与天然低共熔溶剂的固液比为50mg/ml，超声温度为50℃，超声时间为60min；

18、和/或，所述离心的条件为8000r/min，离心时间为20min。

19、中心复合设计实验中，考察因素包括辛酸与癸酸摩尔比x1、固液比x2、超声时间x3；所述辛酸与癸酸摩尔比x1的范围为0.4-3.6、固液比x2的范围为17.3-82.7mg/ml、超声时间x3的范围为13.9-71.1min、超声温度固定在50℃。

20、所述中心复合设计实验获取的回归方程的模型差异p＜0.05，失拟项＞0.05，模型r2＞0.999，模型校正系数radj2＞0.99。

21、所述中心复合设计实验中，利用二次回归分析获得的回归方程为

22、y2＝-107.180+41.205×x1+2.236×x2+1.912×x3-10.905×x12-0.021×x22-0.022×x32+0.134×x1x2-0.024×x1x3-0.004×x2x3。

23、所述预测的最佳工艺条件为：辛酸与癸酸摩尔比2.25：1、液固比为66.17：1、超声时间49.13min、超声温度50℃。

24、利用天然低共熔溶剂从佐夫色绿藻中提取角黄素的工艺，包括：

25、获取摩尔比为2-3:1的辛酸与癸酸作为天然低共熔溶剂；

26、将该天然低共熔溶剂与佐夫色绿藻粉按照50-90mg/ml的固液比进行混合，在35-65℃超声温度下，超声30-60min获得提取液；

27、离心后获得提取样品。

28、本发明技术方案，具有如下优点：

29、1.本发明提供的利用天然低共熔溶剂从佐夫色绿藻中提取角黄素的方法，能够有效通过对不同工艺条件下的角黄素提取效率进行考察，从而预测出最佳的提取工艺条件，以达到无需大量实验也能获取最佳工艺条件从而进一步提高角黄素提取效率的目的。

30、2.本发明提供的利用天然低共熔溶剂从佐夫色绿藻中提取角黄素的方法，可以有效克服现有技术中的提取方法对佐夫色绿藻中角黄素的提取存在提取效果并不理想的缺陷，从而提供安全绿色、提取效率更高的天然低共熔溶剂用于从佐夫色绿藻中提取富含角黄素的类胡萝卜，该法显著优于常规研磨角黄素提取方法，使提取效率提高到60.52μg/ml。