一种人cik细胞体外扩增的分阶段培养方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种人cik细胞体外扩增的分阶段培养方法及其应用。
背景技术：
2.cik细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，cik），是一种新型的免疫活性细胞，cik增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达 cd3 和 cd56 两种膜蛋白分子，故又称为nk 细胞（自然杀伤细胞）样t淋巴细胞，兼具有 t 淋巴细胞强大的抗瘤活性和 nk 细胞的非mhc限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，cik 细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的方案。
3.cik细胞的体外扩增需要外源性细胞因子，如il-2、il-7、il-12等细胞因子的辅助，这些因子控制着人免疫系统内各种抗原特异性细胞的扩增及其生物学活性。外源性il-2、il-7、il-12可以显著促进淋巴细胞的生长，尤其存在有il-2和il-7条件下cik细胞的增殖率为高，且外源性il-2、il-7、il-12对cik细胞的细胞毒活性没有影响, marten a等人研究发现，il-12摄取阻断会减弱cik细胞的细胞毒活性。外源性il-2和il-7的刺激会降低cik细胞表面相应受体的表达量，而cd28分子在il-7存在条件下较il-2时表达更高。il-12会降低cik细胞表面icam-1的表达，il-7则会提高cd56的表达。与il-2相比，il-7可明显增加cd4+细胞的比例。抗cd3mcab不仅在cik细胞培养过程中起着重要作用，在提高cik细胞对白血病及淋巴瘤的杀伤敏感性上同样具有促进作用。lefterov将抗cd3mcab与靶细胞预先共同孵育可增加cik细胞对其的杀伤敏感性，而且这种增强作用可以被抗fcr的抗体（如抗cd36、抗cd32）所部分阻断，间接证明抗cd3mcab引发的杀伤活性增高与fcr介导的抗体结合有关。因此，d-cik细胞应用于恶性肿瘤患者的治疗，有助于解除肿瘤患者体内t细胞的免疫无能，从而提高抗肿瘤活性。
4.虽然外源性il-2、il-7和il-12培养过程中均可出现少量凋亡细胞，但有研究显示外源性il-12的添加会增加cik细胞中坏死细胞的比例，进而影响后续cik细胞在肿瘤治疗中的效果。
技术实现要素：
5.为解决现有技术中存在的技术问题，在使用外源性il-2、il-7、il-12和cd28抗体诱导cik细胞的体外扩增培养方案的基础上，通过分阶段选择性的添加细胞因子，提供了一种新的人cik细胞体外扩增的方法及其应用，解决了现有技术中因外源性il-12的添加导致cik细胞中坏死细胞比例增加的技术问题。
6.具体地，本技术提供了一种人cik细胞体外扩增的分阶段培养方法，该方法包括以下步骤：
1）外周静脉血的采集2）单个核细胞（pbmc）的分离3）初次诱导：将分离得到的pbmc接种于添加有il-2、il-7和il-12的初次诱导培养基中培养，其中，il-2的浓度为900u/ml～1200u/ml，il-7的浓度为500u/ml～800u/ml，il-12的浓度为600u/ml～900u/ml；4）再次诱导：使用含有il-2、il-7和cd28抗体的再次诱导培养基进行培养，其中，il-2的浓度为900u/ml～1200u/ml，il-7的浓度为500u/ml～800u/ml，cd28抗体的浓度为1.5μg/ml～3.0μg/ml。
7.5）收获cik细胞。
8.优选地，步骤2）中采用聚蔗糖-泛影葡胺作为分层液进行单个核细胞的分离。
9.优选地，步骤3）初次诱导的培养时间为60h。
10.优选地，步骤4）再次诱导的培养时间为15d，每隔3d换液，更换的新培养基均为再次诱导培养基。
11.优选地，步骤3）中il-2的浓度为900u/ml～1000u/ml，il-7的浓度为700u/ml～800u/ml，il-12的浓度为700u/ml～800u/ml。
12.优选地，步骤4）中il-2的浓度为900u/ml～1000u/ml，il-7的浓度为700u/ml～800u/ml，cd28的浓度为1.5μg/ml～2.0μg/ml。
13.优选地，初次诱导培养基和再次诱导培养基中还添加了体积分数为10%的血清。
14.优选地，初次诱导培养基中还添加了ifn-γ，ifn-γ的浓度为300u/ml～400u/ml。
15.优选地，还包括对收获的cik细胞进行计数的步骤。
16.本技术还提供了上述人cik细胞体外扩增的分阶段培养方法在制备cik细胞中的应用。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本技术通过分阶段两次诱导，缩短il-12诱导作用的时间，避免由于il-12长时间接触而导致的坏死细胞比例增加。结果显示，本技术的分阶段两次诱导法所得到的cik细胞中坏死细胞比例明显比现有技术中常用的连续诱导培养法更低，且坏死率受到初次诱导时间的影响，当初次诱导时间为60h时，坏死率最低为1.02%，比对照组降低了69.7%。本技术得到的cik细胞坏死率低，活性高，能够广泛应用于肿瘤的治疗中。
具体实施方式
18.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
19.实施例11）外周静脉血的采集2）单个核细胞（pbmc）的分离取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类
计数。再加入等量hank＇s液混匀。取2ml聚蔗糖-泛影葡胺分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2：1～3：1为宜。置水平离心机中，2000r／min离心20min。离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层（含血小板和破碎细胞）。用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。加入4倍量以上的hank＇s液，充分混匀，1000r／min离心10min。离心后倾弃上清液，再用hank＇s液洗2次。用含10％～20％灭活小牛血清的hank＇s液或培养液配制细胞悬液。计数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。
20.3）初次诱导将分离得到的pbmc接种至含有15ml初次诱导培养基的细胞培养瓶中，置于37%、5%co2培养箱中培养，培养时间为60h。
21.初次诱导培养基：gt-t581培养基，其中添加有900u/ml il-2、500u/ml il-7、600u/ml il-12、300u/ml ifn-γ和体积分数为10%的血清。
22.4）再次诱导将细胞培养瓶中原有的培养基倾倒，使用hank＇s液冲洗细胞2次。加入再次诱导培养基，置于37%、5%co2培养箱中培养15d。每隔3d换液一次，换液时使用新培养基冲洗1-2次，更换的培养基仍为再次诱导培养基，再次诱导培养基：gt-t581培养基，其中添加有900u/ml il-2、500u/ml il-7、1.5μg/ml cd28抗体和体积分数为10%的血清。
23.5）使用胰蛋白酶消化收获cik细胞。
24.实施例21）外周静脉血的采集2）单个核细胞（pbmc）的分离取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量hank＇s液混匀。取2ml聚蔗糖-泛影葡胺分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2：1～3：1为宜。置水平离心机中，2000r／min离心20min。离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层（含血小板和破碎细胞）。用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。加入4倍量以上的hank＇s液，充分混匀，1000r／min离心10min。离心后倾弃上清液，再用hank＇s液洗2次。用含10％～20％灭活小牛血清的hank＇s液或培养液配制细胞悬液。计数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。
25.3）初次诱导将分离得到的pbmc接种至含有15ml初次诱导培养基的细胞培养瓶中，置于37%、5%co2培养箱中培养，培养时间为60h。
26.初次诱导培养基：gt-t581培养基，其中添加有1200u/ml il-2、800u/ml il-7、900u/ml il-12、400u/ml ifn-γ和体积分数为10%的血清。
27.4）再次诱导将细胞培养瓶中原有的培养基倾倒，使用hank＇s液冲洗细胞2次。加入再次诱导培
cd28抗体、300u/ml ifn-γ和体积分数为10%的血清。
36.4）使用胰蛋白酶消化收获cik细胞。
37.实施例5propidium iodide（pi）能透过坏死细胞膜，将坏死细胞染成红色，与正常细胞区分开；hoechst 33258能透过正常细胞膜，并与染色体结合，能显示正常细胞和凋亡细胞，凋亡细胞染色增强变亮，并出现核染色质浓缩、边移和碎裂。
38.将灭菌盖玻片凃多聚赖氨酸，晾干后置入24孔板。细胞计数并接种，24孔板，每孔接种5万个细胞。接种24小时后，用无糖平衡盐洗两遍，加入pi和hoechst 33258（用无糖平衡盐溶液配制成0.01 mg/ml,即稀释100倍），避光温浴10分钟，用无糖平衡盐缓冲液洗两遍后，加用4%多聚甲醛固定10分钟。无糖平衡盐缓冲液清洗多聚甲醛，然后夹取盖玻片放在载玻片上，荧光显微镜观察摄像。pi荧光为红色（620nm）在盖玻片的四个象限，随机拍摄三个视野（200倍下），总共有12个视野。统计12个视野的细胞总数、坏死细胞数和凋亡细胞数，并算作一个样本。
39.对实施例1-4收获得到的cik细胞使用上述方法统计坏死细胞数目和凋亡细胞数目，计算坏死率和凋亡率。
40.坏死率=坏死细胞数/细胞总数
×
100%；凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数
×
100%。
41.结果如表1所示，分阶段两次诱导法得到的cik细胞的坏死率最低可达1.02%，明显低于实施例3中的连续诱导法，坏死率下降了69.7%；分阶段两次诱导法得到的cik细胞的凋亡率最低可达1.53%，略低于实施例3中的连续诱导法，凋亡率下降了16.8%，说明分阶段二次诱导法能够有效避免因il-12长时间诱导引发的坏死率增加。
42.未使用il-12诱导的实施例4中，虽然其坏死率与分阶段两次诱导法相当，但收获得到cik细胞数量却低了一个数量级，说明il-12在cik细胞的体外扩增中发挥着重要作用。
43.表1：不同诱导法得到的cik细胞的细胞总数、坏死率和凋亡率组别实施例1实施例2实施例3实施例4cik细胞总数1.32
×
1091.37
×
1091.40
×
1090.65
×
109坏死率1.02%1.21%3.37%1.28%凋亡率1.76%1.53%1.84%1.63%实施例6为了探究初次诱导时间（即il-2的作用时间）对cik细胞坏死率的影响，将初次诱导时间设置为24h、36h、48h、60h和72h，其他步骤均与实施例1相同。细胞计数方法如实施例5所示，结果如下：表2：初次诱导时间对cik细胞坏死率和凋亡率的影响组别24h36h48h60h72hcik细胞总数0.37
×
1090.46
×
1091.02
×
1091.23
×
1091.39
×
109坏死率1.09%1.11%1.23%1.22%1.67%凋亡率1.52%1.48%1.55%1.49%1.53%il-2的作用时间对cik细胞总数和坏死率的影响较大，随着初次诱导时间（即il-2的作用时间）的增加，cik细胞总数和坏死率逐渐增加，综合两方面的效果，确定60h为最佳
初次诱导时间。
44.以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。