一种工程化改造M2巨噬细胞及其应用

一种工程化改造m2巨噬细胞及其应用
技术领域
1.本发明涉及了一种工程化改造m2巨噬细胞，具体涉及一种工程化改造m2巨噬细胞及其应用。


背景技术：

2.脊髓损伤是一种中枢神经系统的急性创伤性疾病，由直接或间接施加于脊髓的外力引起，并导致损伤部位的神经元和神经胶质细胞在几分钟到几小时内死亡。细胞死亡之后的延迟性、继发性损伤阶段，表现为持续存在的神经炎症反应，以免疫细胞激活和炎性细胞因子释放为特征，最终导致永久性的神经功能缺损。
3.sci神经炎症反应时，由于血-脊髓屏障的破坏和血管损伤，外周巨噬细胞被快速招募进入受损组织中，在局部微环境内的不同细胞因子和信号通路的调控下，表现为极化现象，即m1极化型与m2极化型巨噬细胞。这两种状态的巨噬细胞功能迥异甚至相互拮抗，m1极化型巨噬细胞释放炎症介质，促进组织细胞的变性和坏死，从而加重损伤程度；m2极化型巨噬细胞则通过清除细胞碎片、释放营养因子和重塑细胞外基质，促进创伤愈合。sci后数小时内，巨噬细胞首先响应ifn-γ、lps、tnf-α和其他刺激信号，极化为m1巨噬细胞，并在sci后第1天达到峰值。sci损伤持续发展时，局部微环境中巨噬细胞集落刺激因子、il-4、il-13等刺激活化因子作用下，m2型极化巨噬细胞数量增加。m2巨噬细胞高表达il-10、il-4、il-13、tgf-β和神经营养因子，可抑制m1巨噬细胞的促炎作用，抑制神经元凋亡，促进神经组织修复，特别是促进轴突的延伸。单细胞测序实验结果发现sci后一周之内巨噬细胞总数呈增高趋势，其中m2巨噬细胞在第3天达到顶峰，但是在第7天的脊髓组织中m2巨噬细胞的数量呈现断崖式下降。
4.关于sci后早期大量涌现出来的m2巨噬细胞如何快速消失的事件至今是一个未解之谜。通常细胞的消失死亡，可能是细胞坏死或者凋亡，比如大家所熟知的细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡。然而坏死性凋亡一般是在sci后3-6小时之间发生，大部分是脊髓自身的细胞在原发性损伤诱导后发生的，主要是一些对于缺血缺氧敏感的神经元会发生坏死。细胞焦亡是依赖于caspase-1激活的炎症性凋亡模式。已经有大量的报道显示关节炎中招募来的m1巨噬细胞可发生细胞焦亡，加剧炎症反应，发挥细胞毒性损伤作用。sci后第3-14天时间段，这个时候正是脊髓白质髓鞘变性崩解，产生了大量的脂质碎片的时候。m2巨噬细胞的职责是吞噬清除细胞碎片，清理损伤创口。在sci损伤的微环境中m2巨噬细胞吞噬了大量的脂质碎片，这是与其脊髓中其他细胞截然不同。
5.铁死亡是一种铁依赖性程序性细胞死亡，以脂质过氧化物和ros的细胞积累为特征，在基因和生化上不同于以往大家所认识的细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡。有学者发现，发生sci后，脊髓表现出大量出血、红细胞聚集、细胞破裂以及溶血和局部铁超载。sci大鼠脊髓组织中的铁死亡标志物发生了明显的升高，利用透射电镜还观察到了具有铁死亡特征的线粒体的变化，从而证实铁死亡在sci中起重要作用。由于m2巨噬细胞数量减少，不能有效清除所有的髓鞘脂质碎片，sci第14天的脊髓组织中仍旧有大量髓鞘碎片(oro红色染
色)，不利于sci的修复再生。抑制m2巨噬细胞的铁死亡现象成为预防和治疗脊髓损伤的一个重要方向，但迄今尚未发现有效方法。
6.目前有关生物纳米磁颗粒(又称磁小体)研究的最新成果发现磁小体是由趋磁细菌合成的。趋磁细菌是有鞭毛的革兰氏阴性菌，这些细菌含有一种独特的细胞内细胞器，即磁小体，它是一种磁性纳米颗粒，由脂质双层膜包围的磁铁矿(fe3o4)组成，所以能够定向到磁场，这种行为被称为“趋磁”。趋磁细菌dna中含有称为磁小体岛的保守区域，该区域由mamab、mamgfdc、mms6和mamxy操纵子组成。其中mms6基因促进均匀同晶超顺磁性磁铁矿纳米晶体的形成，并有助于调节磁铁矿的晶体形态。磁小体的形成过程中可以消耗细胞内游离铁离子，且fe3o4表现出与天然过氧化物酶(例如hrp)相似的过氧化物酶活性，磁小体还可以清除ros。
7.哺乳动物基因组中不存在mms6基因，但当哺乳动物细胞表达mms6后也可在细胞内生成磁小体，mms6编码的小分子蛋白mms6与游离fe
3+
和fe
2+
均有较强的结合能力。据文献报道，在哺乳动物细胞内，游离fe
3+
易结合于储铁蛋白内或者被溶酶体吞噬，但一部分可被还原为游离fe
2+
；当游离fe
2+
增加，可通过芬顿反应释放大量ros，造成线粒体和dna氧化应激损伤，从而破坏质膜并诱导铁死亡。但其在m2巨噬细胞中发挥调控脊髓损伤的作用还值得进一步探索。


技术实现要素：

8.为了解决背景技术中存在的问题，本发明所提供一种工程化改造巨噬细胞及其应用，目的是治疗脊髓损伤。目前发现通过移植插入源自趋磁细菌的外源基因并不会加重干细胞移植中的免疫反应，这一证据进一步提示mms6表达的m2巨噬细胞可能具有免疫安全性。因此，开发一种表达mms6的m2巨噬细胞十分必要，并具有迫切的临床需求和广阔的应用前景。
9.本发明采用的技术方案是：
10.本发明巨噬细胞表达mms6基因小鼠模型的构建方法具体如下：
11.所述方法将含有编码mms6基因的重组质粒导入小鼠的巨噬细胞中，最终构建出mms6基因型小鼠模型；所述方法中mms6基因核苷酸序列如seq id no.1所示，所述方法的具体步骤包括：
12.步骤1)利用所述含有编码mms6基因的重组载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞并培养后获得慢病毒。
13.步骤2)将步骤1)得到的慢病毒转染小鼠来源的巨噬细胞，从而获得表达mms6基因的小鼠。
14.所述的含有编码mms6基因的重组载体具体为重组慢病毒载体。
15.所述的重组慢病毒载体可为重组质粒ubi-mms6，重组质粒ubi-mms6具体为将mms6基因插入到载体ubi-mcs-3flag-cbh-gcgfp-ires-puro的多克隆位点之间，即插入到限制性内切酶bamhi的识别位点和agel识别位点之间，最终得到重组质粒ubi-mms6。
16.所述的慢病毒包装质粒具体为phelper 1.0和phelper 2.0。
17.所述的质粒转染慢病毒包装细胞具体为293t细胞。
18.所述的巨噬细胞可为raw264.7细胞或mms6-raw细胞。
19.一种巨噬细胞表达mms6基因小鼠模型的应用：
20.所述的应用包括在制备用于预防和/或治疗由炎症引起的疾病的产品中的应用。还包括在预防和/或治疗由炎症引起的疾病的研究中的应用。
21.一种巨噬细胞表达mms6基因小鼠模型的应用：
22.所述的应用包括在制备具有抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复的产品中的应用。
23.一种巨噬细胞表达mms6基因小鼠模型的应用：
24.所述的应用包括在抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复的研究中的应用。
25.一种巨噬细胞表达mms6基因小鼠模型得到改造的巨噬细胞：
26.所述的改造的巨噬细胞为表达mms6基因的m2巨噬细胞。
27.一种巨噬细胞表达mms6基因小鼠模型得到改造的巨噬细胞：
28.所述的巨噬细胞在制备用于治疗脊髓损伤的产品中的应用。还包括在治疗脊髓损伤中的应用。所述产品可为药物。通过该巨噬细胞制备的产品可以预防和/或治疗由炎症引起的疾病、促进损伤组织修复以及治疗脊髓损伤。由炎症引起的疾病为创伤性神经损伤。所述创伤性神经损伤具体可为脊髓损伤。
29.本发明的有益效果是：
30.本发明方法制备的mms6基因改造的m2巨噬细胞使得小鼠的脊髓修复功能显著提高，且可以治疗脊髓损伤，同时可以抵抗m2巨噬细胞铁死亡，解决了m2巨噬细胞在脊髓损伤部位数量减少的问题，具有重要的应用价值。
附图说明
31.图1的(a)为实施例1和2中的mms6基因的检测结果的100
×
物镜下的明场图；
32.图1的(b)为实施例1和2中的mms6基因的检测结果的100
×
物镜下的荧光图；
33.图2为qrt-pcr方法检测mms6-raw细胞中mms6基因的表达结果示意图；
34.图3的(a)为tem方法检测mms6-raw细胞中磁性小体在1μm比例尺下的结果示意图；
35.图3的(b)为tem方法检测mms6-raw细胞中磁性小体在0.5μm比例尺下的结果示意图；
36.图3的(c)为tem方法检测mms6-raw细胞中磁性小体在0.2μm比例尺下的结果示意图；
37.图4的(a)为实施例1的脑室内注射mms6转染的m2巨噬细胞对sci后小鼠bms评分的实验结果；
38.图4的(b)为实施例1的脑室内注射mms6转染的m2巨噬细胞对sci后小鼠bms副评分实验结果；
39.图5的(a)为实施例2的尾静脉注射mms6转染的m2巨噬细胞对sci后小鼠bms评分的实验结果；
40.图5的(b)为实施例2的尾静脉注射mms6转染的m2巨噬细胞对sci后小鼠bms副评分实验结果。
具体实施方式
41.下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
42.本发明的巨噬细胞表达mms6基因小鼠模型的构建方法将含有编码mms6基因的重组质粒导入小鼠的巨噬细胞中，最终构建出mms6基因型小鼠模型；所述方法中mms6基因核苷酸序列如seq id no.1所示，所述方法的具体步骤包括：
43.步骤1)利用所述含有编码mms6基因的重组载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞并培养后获得慢病毒。含有编码mms6基因的重组载体具体为重组慢病毒载体。重组慢病毒载体可为重组质粒ubi-mms6，重组质粒ubi-mms6具体为将mms6基因插入到载体ubi-mcs-3flag-cbh-gcgfp-ires-puro的多克隆位点之间，即插入到限制性内切酶bamhi的识别位点和agel识别位点之间，最终得到重组质粒ubi-mms6。慢病毒包装质粒具体为phelper 1.0和phelper 2.0。质粒转染慢病毒包装细胞具体为293t细胞。
44.步骤2)将步骤1)得到的慢病毒转染小鼠来源的巨噬细胞，从而获得表达mms6基因的小鼠。巨噬细胞可为raw264.7细胞或mms6-raw细胞。
45.巨噬细胞表达mms6基因小鼠模型的应用包括在制备用于预防和/或治疗由炎症引起的疾病的产品中的应用。还包括在预防和/或治疗由炎症引起的疾病的研究中的应用。应用包括在制备具有抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复的产品中的应用。应用包括在抑制炎症反应和/或促进损伤组织修复的研究中的应用。
46.巨噬细胞表达mms6基因小鼠模型得到改造的巨噬细胞为表达mms6基因的m2巨噬细胞。改造的巨噬细胞在制备用于治疗脊髓损伤的产品中的应用。还包括在治疗脊髓损伤中的应用。所述产品可为药物。通过该巨噬细胞制备的产品可以预防和/或治疗由炎症引起的疾病、促进损伤组织修复以及治疗脊髓损伤。由炎症引起的疾病为创伤性神经损伤。所述创伤性神经损伤具体可为脊髓损伤。
47.下述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
48.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的常规培养基均为含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基。
49.实施例1：
50.制备稳定表达mms6基因的巨噬细胞株，即慢病毒ubi-mms6感染的raw264.7细胞的获得及其分泌mms6基因的检测：
51.步骤1)利用含有编码mms6基因的重组载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞并培养后获得慢病毒，具体如下：
52.1.1)含有编码mms6基因的重组载体的构建，即重组质粒ubi-mms6的构建：
53.向载体ubi-mcs-3flag-cbh-gcgfp-ires-puro的限制性内切酶agel的识别位点和bamhi识别位点之间插入mms6基因，得到重组质粒ubi-mms6，重组质粒ubi-mms6表达mms6基因。
54.1.2)质粒转染与慢病毒收获：
55.在转染前的24h，将细胞密度为1
×
106细胞/孔的293t细胞接种到6孔板中，293t细胞在含10％胎牛血清的dulbecco's改良培养基(dulbecco's modified eagle medium，
dmem)中并于37℃、5％co2的培养箱中培养，24h后待293t细胞的细胞密度达70％～80％时进行转染；在转染前的2h将培养箱中的细胞培养基更换为无血清培养基。
56.向一灭菌离心管中加入所制备的dna溶液，dna溶液中包括20μg的gv载体质粒、15μg的phelper1.0载体质粒和10μg的phelper2.0载体质粒，与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min获得混合液。将混合液缓慢滴加至培养箱中的293t细胞的无血清培养基中并混匀，于37℃、5％ co2的培养箱中继续培养；在缓慢滴加的过程一定要均匀，尽可能地不要将细胞吹起。
57.继续培养6h后弃去含有混合液的无血清培养基，即弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的pbs液清洗一次，轻柔晃动以洗涤残余的转染混和物后倒弃；293t细胞始终贴壁。缓慢加入20ml的含10％血清的细胞培养基，于37℃、含5％ co2的培养箱内继续培养48-72h。
58.1.3)慢病毒ubi-mms6的浓缩与纯化：
59.在293t细胞经步骤1.2)培养并转染成功后的48h时收集293t细胞上清液；于4℃、4000g下离心10min，除去293t细胞上清液中的细胞碎片；以0.45μm的滤器过滤293t细胞上清液于若干40ml超速离心管中；分别配平样品(超离管对称配平，误差小《0.01g)，将各个超速离心管逐一放入至beckman超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃进行离心；离心结束后，弃去各个超速离心管中的上清液，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，病毒保存液可用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，pbs)或细胞培养基替代，然后轻轻反复吹打重悬各个超速离心管。在超速离心管中的液体充分溶解后，继续高速离心10000rpm，离心5min后，取各个超速离心管中的上清并按要求分装，即获得慢病毒ubi-mms6浓缩液。该步骤病毒回收会存在一定程度损失，尽可能地避免病毒长时间暴露在室温中。
60.步骤2)将步骤1)得到的慢病毒转染小鼠的巨噬细胞，从而获得表达mms6基因的小鼠。
61.2.1)慢病毒转染小鼠的巨噬细胞的获得，即稳定表达mms6基因的巨噬细胞株的获得：
62.取24孔板，向其中一个孔接种约1
×
103个raw264.7细胞，然后加入0.5ml常规培养基和20μl慢病毒ubi-mms6浓缩液，在37℃、5％co2的培养箱中培养72h；然后加入嘌呤霉素，得到体系；该体系中，嘌呤霉素的浓度为10ng/ml。将体系于37℃、5％co2的培养箱中继续培养24h，先弃掉上清液，用pbs缓冲液洗涤一次，然后加入0.5ml常规培养基，获得慢病毒ubi-mms6转染的raw264.7细胞，即稳定表达mms6基因的巨噬细胞株；其中未转染慢病毒ubi-mms6的raw264.7细胞培养时被嘌呤霉素杀死。
63.将慢病毒ubi-mms6转染的raw264.7细胞置于倒置荧光显微镜下(慢病毒ubi-mms6转染的raw264.7细胞以下简称mms6-raw细胞)，在450～490nm蓝光波长的激发光照射下观察，实验结果见图1的(a)和(b)所示，由于载体ubi-mcs-3flag-cbh-gcgfp-ires-puro能够表达绿色荧光蛋白，所以mms6-raw细胞可呈现出绿色荧光。
64.对制备得到mms6-raw细胞进行mms6基因的检测，具体如下：
65.使用qrt-pcr方法检测mms6-raw细胞中mms6基因的表达，首先取六孔板，先加入1
×
105个mms6-raw细胞，然后加入2ml常规培养，于37℃、5％co2条件下培养48h，然后弃去上
清，用1ml胰蛋白酶消化每孔中的细胞，并在500g离心条件下离心5min后收集孔内的细胞，按照rna提取试剂盒的操作步骤，提取收集的细胞样本中的rna。
66.然后配置pcr反应体系，具体如下：
67.根据下表1的比例分别配制含有mms6和gapdh基因的qpcr引物的反应体系：
68.表1
[0069][0070]
含有mms6和gapdh基因的qpcr引物的核苷酸序列如seq id no.2-5所示。
[0071]
然后进行pcr反应：设定程序为两步法real-time定量。预变性为95℃，15s，之后每一步变性95℃，5s，退火延伸60℃，30s，共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。
[0072]
pcr反应结束后，制作溶解曲线，在95℃变性1min，然后冷却至60℃保持1min，使dna双链充分结合。从60℃开始，每步增加0.5℃，保持30s，同时读取吸光值。
[0073]
最终mms6基因相对表达结果如图2所示，结果表明，mms6-raw细胞中有mms6基因的表达。
[0074]
2.2)mms6-raw细胞脑室注射治疗小鼠脊髓损伤：
[0075]
下述实验中，小鼠为浙江大学实验动物中心提供的雌性健康c57bl/6野生型小鼠产品，pbs缓冲液为ph7.2-7.4、67mm po4(不含ca和mg)的pbs缓冲液。
[0076]
取24只、8周的c57bl/6雌性野生型小鼠，脊髓打击(从20cm高的位置用5g的打击器击打t10)，制备小鼠脊髓损伤模型。3天后，将24只c57bl/6野生型小鼠随机分成pbs组、con-m2组和mms6-m2组三组(每组8只)，然后进行如下处理：
[0077]
pbs组(阴性对照组)：每只小鼠脑室注射5μl的pbs缓冲液。
[0078]
con-m2组(阴性对照组)：每只小鼠脑室注射5μl的con-m2细胞悬液。
[0079]
con-m2细胞悬液的制备方法为：con-raw细胞中加入il-4诱导，收集con-m2细胞，然后用pbs缓冲液重悬，得到细胞浓度为5
×
105个/ml的con-m2细胞悬液。
[0080]
mms6-m2组(实验组)：每只小鼠脑室注射5μl的mms6-m2细胞悬液。
[0081]
mms6-m2细胞悬液的制备方法为：mms6-raw细胞中加入il-4诱导，收集mms6-m2细胞，然后用pbs缓冲液重悬，得到细胞浓度为5
×
105个/ml的mms6-m2细胞悬液。
[0082]
完成上述步骤后，观察各组小鼠的运动功能恢复情况。实验结果见图3的(a)和(b)所示(pbs为pbs组，con-m2为con-m2组，mms6-m2为mms6-m2组)。结果表明，pbs组和con-m2组小鼠脊髓恢复功能较差，mms6-m2组小鼠脊髓运动功能评分高于pbs组和con-m2组，差异均有统计学意义。由此可见，实施例1制备的mms6-m2细胞可以用于治疗脊髓损伤。
[0083]
实施例2：
[0084]
稳定表达mms6基因的巨噬细胞株，即慢病毒ubi-mms6感染的mms6-raw细胞的获得及其分泌mms6基因的检测：
[0085]
制备mms6-raw细胞和con-raw细胞的方法与实施例1中的步骤2.1)及之前的步骤相同，之后进行mms6-raw细胞尾静脉注射治疗小鼠脊髓损伤：
[0086]
取24只、8周的c57bl/6雌性野生型小鼠，脊髓打击(从20cm高的位置用5g的打击器击打t10)，制备小鼠脊髓损伤模型。3天后，将24只c57bl/6野生型小鼠随机分成pbs组、con-m2组和mms6-m2组三组(每组8只)。然后进行如下处理：
[0087]
pbs组(阴性对照组)：每只小鼠尾静脉注射200μl的pbs缓冲液。
[0088]
con-m24组(阴性对照组)：每只小鼠尾静脉注射200μl的con-m2细胞悬液。
[0089]
con-m2细胞悬液的制备方法为：con-raw细胞中加入il-4诱导，收集con-m2细胞，然后用pbs缓冲液重悬，得到细胞浓度为1
×
106个/ml的con-m2细胞悬液。
[0090]
mms6-m2组(实验组)：每只小鼠尾静脉注射200μl的mms6-m2细胞悬液。
[0091]
mms6-m2细胞悬液的制备方法为：mms6-raw细胞中加入il-4诱导，收集mms6-m2细胞，然后用pbs缓冲液重悬，得到细胞浓度为1
×
106个/ml的mms6-m2细胞悬液。
[0092]
完成上述步骤2后，观察各组小鼠的运动功能恢复情况。实验结果见图4的(a)和(b)所示(pbs为pbs组，con-m2为con-m2组，mms6-m2为mms6-m2组)。结果表明，pbs组和con-m2组小鼠脊髓恢复功能较差，mms6-m2组小鼠脊髓运动功能评分高于pbs组和con-m2组，差异均有统计学意义。由此可见，实施例2制备的mms6-m2细胞可以用于治疗脊髓损伤。
[0093]
对比例1：
[0094]
制备mms6-raw细胞的对比转染细胞，即con-raw细胞，con-raw细胞的制备方法与实施例1中的mms6-raw细胞相同，但是制备con-raw细胞时使用的重组质粒为质粒mms6-con，即载体ubi-mcs-3flag-cbh-gcgfp-ires-puro，最终得到慢病毒ubi-con浓缩液，进而得到慢病毒ubi-con转染的raw264.7细胞，即con-raw细胞。
[0095]
在制备得到con-raw细胞后进行和实施例1中的mms6-raw细胞相同的mms6基因的检测，最终mms6基因相对表达结果如图2所示，结果表明，con-raw细胞中没有mms6基因的表达。
[0096]
为了进一步证实实施例1中的mms6-raw细胞中mms6基因成功转进细胞，我们在制备得到mms6-raw细胞后进行透射电镜(transmission electron microscopy，tem)检测，观察mms6-raw细胞中磁性小体的形成，具体如下：
[0097]
使用tem方法检测mms6-raw细胞中磁性小体的形成，首先取10cm培养皿，先加入5
×
106个mms6-raw细胞，然后加入10ml常规培养基培养，于37℃、5％co2条件下培养24h，然后加入24μm奎宁酸铁，培养24小时，弃去上清，用pbs缓冲液清洗细胞，用细胞刮棒刮取培养皿中的细胞，并在500g离心条件下离心5min后收集培养皿中的细胞，按照下列步骤开始电镜样本制备。
[0098]ⅰ、双固定：
[0099]
1、样品在2.5％的戊二醛溶液中，4℃固定过夜。
[0100]
2、倒掉固定液，用0.1m，ph7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min。
[0101]
注意：用足够量的pbs缓冲液充分漂洗。
[0102]
3、用1％的锇酸溶液固定样品1-2h。
[0103]
注意：锇酸为剧毒试剂，必须在通风橱中、并在老师指导下使用；废液安全收集。
[0104]
4、小心取出锇酸废液，用0.1m，ph7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min。
[0105]
注意：用足够量的pbs缓冲液充分漂洗。
[0106]ⅱ、脱水：
[0107]
用梯度浓度(包括30％、50％、70％和80％)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，此后，过渡到90％和95％的丙酮溶液中，分别处理15min。最后用纯丙酮处理两次，每次20min。(注意：等待过程中，摇晃样品，充分脱水。)
[0108]
注意：1、从70％浓度开始，必须盖盖子，防止挥发；2、每个步骤中，确保样品不会长时间离开液体。
[0109]ⅲ、渗透：
[0110]
1、用spurr包埋剂与丙酮的混合液(v/v＝1/1)处理样品1h。
[0111]
2、用spurr包埋剂与丙酮的混合液(v/v＝3/1)处理样品3h。
[0112]
3、室温下，纯包埋剂处理样品过夜。
[0113]
注意：保持干燥，不要有水混入。
[0114]ⅳ、包埋、切片及染色观察：
[0115]
1、将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。
[0116]
2、样品在leica em uc7型超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片。
[0117]
3、切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色5-10min。
[0118]
4、在hitachi h-7650型透射电镜中观察。
[0119]
最终细胞内磁性小体的结果如图3的(a)、(b)和(c)所示，结果表明，mms6-raw细胞中有磁性小体的产生。
[0120]
本发明制备了表达mms6基因的巨噬细胞，即慢病毒ubi-mms6感染的raw264.7细胞。实验证明，向小鼠脊髓损伤模型(t10位置击打制备)脑室注射慢病毒ubi-mms6感染的il-4诱导后的raw264.7细胞后，小鼠的脊髓修复功能显著提高；向脊髓损伤的小鼠的微静脉注射慢病毒ubi-mms6感染的il-4诱导后的raw264.7细胞后，小鼠的脊髓修复功能也显著提高。由此可见，慢病毒pcdh-mil4感染的raw264.7细胞可以治疗脊髓损伤。同时实验证明慢病毒ubi-mms6感染的il-4诱导后的raw264.7细胞可以抵抗m2巨噬细胞铁死亡，解决了m2巨噬细胞在脊髓损伤部位数量减少的问题。本发明具有重要的应用价值。
[0121]
本发明涉及的序列如下：
[0122]
seq id no.1：mms6-m2细胞核苷酸序列
[0123]
dna类型：genomic dna
[0124]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0125]
atggcggagccgagcggctcgcccgtgcacgtccagcttccccagcaggcggccccggtgacagcggcggcggcggcggccccggcggccgcgacagcagcgccggccccggcagctcccgcggccccggccccggccccggccccggcggcacaggctgtcggctggcccatctgcagggacgcgtacgagctgcaggaggttatcggcagtggagctactgctgtggttcaggcagccctatgcaaacccaggcaagaacgtgtagcaataaaacggatcaacttggaaaaatgccagaccagtatggatgaactattaaaagaaattcaagccatgagtcagtgcagccatcccaacgtagtgacctattacacctcttttgtggtcaaagatgaactttggctggtcatgaaattactaagtggaggttcaatgttggatatcataaaatacattgtcaaccgaggagaacacaagaatggagttctggaagaggcaataatagcaacaattcttaaagaggttttggaaggcttagactatctacacagaaacggtcagattcacagggatttgaaagctggtaatattcttctgggtgaggatggttcagtacaaatagcagattttggggtaagtgcgttcctagcaacagggggtgatgttacccgaaataaagtaa
gaaaaacattcgttggcaccccatgttggatggctcctgaagtcatggaacaggtgagaggctatgacttcaaggctgacatgtggagttttggaataactgccattgaattagcaacaggagcagcgccttatcacaaatatcctcccatgaaagtgttaatgttgactttgcaaaatgatccacccactttggaaacaggggtagaggataaagaaatgatgaaaaagtacggcaagtcctttagaaaattactttcactgtgtcttcagaaagatccttccaaaaggcccacagcagcagaacttttaaaatgcaaattcttccagaaagccaagaacagagagtacctgattgagaagctgcttacaagaacaccagacatagcccaaagagccaaaaaggtaagaagagttcctgggtcaagtggtcaccttcataaaaccgaagacggggactgggagtggagtgacgacgagatggatgagaagagcgaagaagggaaagcagctttttctcaggaaaagtcacgaagagtaaaagaagaaaatccagagattgcagtgagtgccagcaccatccccgaacaaatacagtccctctctgtgcacgactctcagggcccacccaatgctaatgaagactacagagaagcttcttcttgtgccgtgaacctcgttttgagattaagaaactccagaaaggaacttaatgacatacgatttgagtttactccaggaagagatacagcagatggtgtatctcaggagctcttctctgctggcttggtggatggtcacgatgtagttatagtggctgctaatttacagaagattgtagatgatcccaaagctttaaaaacattgacatttaagttggcttctggctgtgatgggtcggagattcctgatgaagtgaagctgattgggtttgctcagttgagtgtcagc
[0126]
seq id no.2：mms6 mouse f引物核苷酸序列
[0127]
dna类型：genomic dna
[0128]
来源：小鼠(mus musculus)
[0129]
caccatctggaccggcaagg
[0130]
seq id no.3：mms6 mouse r引物核苷酸序列
[0131]
dna类型：genomic dna
[0132]
来源：小鼠(mus musculus)
[0133]
tctcagctccacctcctcgtc
[0134]
seq id no.4：gapdh mouse f引物核苷酸序列
[0135]
dna类型：genomic dna
[0136]
来源：小鼠(mus musculus)
[0137]
actccactcacggcaaattc
[0138]
seq id no.5：gapdh mouse r引物核苷酸序列
[0139]
dna类型：genomic dna
[0140]
来源：小鼠(mus musculus)
[0141]
tctccatggtggtgaagaca。