一株羊驼源纳米抗体S102及其应用

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一株羊驼源纳米抗体及其应用，更具体地，涉及一种与sars-cov-2s2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防、治疗或检测新冠病毒和/或相关冠状病毒感染的药物中的应用。

背景技术：

1、冠状病毒科(family coronaviridae)的新型冠状病毒(又称sars-cov-2或新冠病毒)，同属冠状病毒科的严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)等也是针对人类呼吸系统的主要病原体，主要通过飞沫、气溶胶和接触等方式传播，因此这类引起呼吸系统疾病的病毒严重危害公共卫生安全，对人民群众的身体健康、生命安全和国民经济发展、社会稳定造成极大威胁。

2、中和抗体类药物主要是通过与病原微生物表面的抗原结合，阻止病原微生物表达的特定分子与细胞表面受体结合，达到“中和”的效果。

3、sars-cov和sars-cov-2病毒表面都具有糖基化的刺突蛋白(spike protein,s)，该s蛋白能与宿主细胞受体蛋白ace2相互作用并触发膜融合，因此阻断s蛋白与ace2的结合是治疗新冠病毒感染的有效途径。s蛋白分为s1亚基和s2亚基，s2亚基与病毒膜和细胞膜的融合相关，靶向s2亚基的抗体可以通过中和机制发挥抗病毒感染的作用。尤其面对新冠病毒这样的rna病毒，具有易突变、易发生免疫逃逸等特点，单一特异性抗体很难满足长久的治疗需求，因此靶向不同表位的中和抗体的分离鉴定迫在眉睫。

4、纳米抗体，也称为单域抗体(vhh)，与传统mab(～150kda)相比，纳米抗体具有一些独特的优势：分子量小(～15kda)、免疫原性低、更好的溶解性和稳定性以及更长的cdr3区域。凭借这些特性，纳米抗体可以作为单个域或模块化单元来构建更复杂的分子，例如针对不同抗原的多价抗体以扩展广谱性。重要的是，纳米抗体可以很容易地雾化并通过吸入器直接输送到肺部，这使它们成为治疗呼吸道疾病的有潜力的药物。因此，分离并鉴定具有交叉反应性的纳米抗体，是应对目前新冠病毒大流行及未来可能出现的冠状病毒感染提供潜在的药物储备。

技术实现思路

1、发明目的

2、本发明的目的在于提供一种与sars-cov-2s2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防或新冠病毒的药物中的应用。本发明的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段为高中和活性的纳米抗体，与sars-cov-2s2蛋白的结合能力强，能有效抑制sars-cov-2原始毒株及其一系列变异毒株以及相关冠状病毒的感染；该纳米抗体具有分子量小(～15kda)、免疫原性小、更好的溶解度和稳定性、较长的cdr3区的优点，可以雾化给药，能直达肺部，起效更快，为新冠或其他冠状病毒感染提供了潜在的治疗策略。

3、解决方案

4、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

5、第一方面，本发明提供了一种与sars-cov-2s2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下的cdr：

6、氨基酸序列如seq id no:1(即，gftfssya)所示的cdr1，

7、氨基酸序列如seq id no:2(即，igsfvtny)所示的cdr2，

8、以及氨基酸序列如seq id no:3(即，rrvqversey)所示的cdr3。

9、在具体的实施方案中，所述重链可变区还包括4个框架区fr1-4，所述fr1-4与所述cdr1、cdr2和cdr3按顺序交错排列。

10、在一个优选的实施方案中，所述fr1-4的氨基酸序列分别如seq id no:4(即，qvqlqesggglvqpggslrlscaas)、seq id no:5(即，mawyrqapgkerelvav)、seq id no:6(即，adsvkgrftisrdnaknmvylqmnslkpedtavyycha)和seq id no:7(即，wgqgtqvtvss)所示。

11、在一个优选的实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示：

12、

13、其中，下划线部分分别为框架区fr1-4，标黑部分分别为重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。

14、第二方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。

15、进一步地，所述多核苷酸为dna或mrna。

16、进一步地，所述多核苷酸具有如seq id no:9所示的核苷酸序列：

17、caggtgcagctgcaggagagcggaggagggctggtgcagcccggaggaagcctgagactgagctgcgccgccagcggatttacctttagcagctatgccatggcatggtatagacaggcccctggaaaagagagagagctggtggcagtgattggaagcttcgtgaccaactacgccgacagcgttaagggaaggttcaccatcagcagagacaacgcaaaaaacatggtgtacctgcagatgaacagcctgaagcccgaggacaccgccgtgtactactgccacgccagaagagtgcaggtggagagaagcgagtactggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagc。

18、第三方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸。

19、进一步优选地，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。例如组氨酸标签、终止密码子等。

20、第四方面，本发明提供一种表达载体，其包含如上述第三方面所述的核酸构建体。

21、第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包括如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的表达载体。

22、第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上述第一方面所述的与sars-cov-2 rbd结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

23、优选地，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。

24、进一步优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。

25、进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；

26、更进一步优选地，所述片剂为舌下片；

27、更进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；

28、更进一步优选地，所述粉末剂为散剂；

29、更进一步优选地，所述丸剂为小丸剂。

30、进一步优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；更进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。

31、第七方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的与sars-cov-2s2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物在制备预防、治疗或检测新冠病毒和/或相关冠状病毒感染的药物中的应用。

32、优选地，所述新冠病毒为sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2变异毒株。

33、进一步优选地，所述sars-cov-2变异毒株为sars-cov-2的alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma(p.1)、kappa(b.1.617.1)和/或delta(b.1.617.2)变异毒株。

34、优选地，所述相关冠状病毒为sars-cov、gx/p2v/2017、gd/1/2019或ratg13。

35、第八方面，本发明提供了一种预防或治疗新冠病毒或相关冠状病毒的方法，其包括：向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的如上述第一方面所述的与sars-cov-2s2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物。

36、作为优选，所述相关冠状病毒为sars-cov、gx/p2v/2017、gd/1/2019或ratg13。

37、第九方面，本发明提供了一种检测新冠病毒或相关冠状病毒的方法，其包括使用如上述第一方面所述的与sars-cov-2s2结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。

38、优选地，所述新冠病毒为sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2变异毒株。

39、进一步优选地，所述sars-cov-2变异毒株为sars-cov-2的alpha(b.1.1.7)、beta(b.1.351)、gamma(p.1)、kappa(b.1.617.1)和/或delta(b.1.617.2)变异毒株。

40、优选地，所述相关冠状病毒为sars-cov、gx/p2v/2017、gd/1/2019或ratg13。

41、本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。

42、有益效果

43、本发明针对新冠病毒进行纳米抗体药物开发，通过用sars-cov-2s蛋白免疫羊驼、构建抗体文库、利用噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体等，筛选到结合sars-cov-2s2的纳米抗体，本文命名为纳米抗体s102。通过表面等离子共振技术检测证实，本发明的纳米抗体s102以高亲和力特异性结合sars-cov-2s2。此外，通过抗体中和试验证实，本发明的纳米抗体s102能以高中和活性中和sars-cov-2原始毒株及其一系列变异毒株以及相关冠状病毒。

44、本发明为新型冠状病毒原始毒株及其变异毒株以及相关冠状病毒感染的临床预防、治疗和检测提供了潜在的纳米抗体新药。