一种抗人醛酮还原酶1B10蛋白单克隆抗体及其应用

本发明属于免疫化学，具体涉及一种抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、肝脏疾病由脂肪肝(肝炎)、肝纤维化、肝硬化和肝癌逐渐演变的过程，目前缺乏一种早期诊断、精准诊断和监测这些肝脏疾病进程的血清标记物；肝脏疾病常导致肝功能异常，监测肝功能的指标包括谷草转氨酶、谷丙转氨酶等，但是，这些标志物在早期诊断和疾病进展等方面仍显不足；肝癌、肺癌和乳腺癌等癌症是威胁人类健康的恶性肿瘤，目前还缺乏有效地针对肝癌、肺癌、乳腺癌早期检测、疗效判断、预后评估或复发监测的有效方法。因此，亟需一种用于特异性高、敏感性高且能用于肝功能、肝脏疾病和人类多种癌症早期筛查、早期诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的新靶标，和一种易操作的、对人体无危害的、具有临床应用价值的检测方法。

2、akr1b10蛋白在正常肝脏中低表达，当肝脏受损时akr1b10蛋白会表达，或者进入血液中的akr1b10蛋白增多，因此，akr1b10蛋白可用于肝功能、肝脏疾病(脂肪肝、肝炎、肝纤维化、肝硬化)和肝癌的早期筛查、早期诊断、疗效判断、预后评估和复发监测。

3、akr1b10蛋白在肺癌、乳腺癌等其它肿瘤中高表达，促进肿瘤的生长和转移，并与肿瘤的耐药性相关。通过抑制或敲降akr1b10基因可以抑制肿瘤的生长和转移，并增加肿瘤对化疗药物的敏感性，促进肿瘤放疗抵抗。在肿瘤细胞中表达的akr1b10蛋白可以通过溶酶体途径分泌到血液中，使肿瘤患者血液中的akr1b10蛋白水平升高。因此，通过检测血液中akr1b10蛋白的水平，可以诊断肿瘤的发生/复发，判断抗肿瘤效果。

4、因此，开发一种基于akr1b10蛋白的一系列用于肝功能、肝脏疾病(脂肪肝、肝纤维化、肝硬化等)以及人类肿瘤的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的检测试剂盒具有重要的临床应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明针对人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1b10(aldo-keto reductase 1b10，akr1b10)蛋白，开发出一种新的特异性单克隆抗体，并以此开发出一个灵敏、特异、高效的诊断试剂盒，用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种产生抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株命名为8d7a9e2和8d7a9h4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号分别为cctcc no：c202141和cctcc no：c202142，保藏日期为2021年01月28日。

4、本发明获得两株鼠源性单抗细胞株，即8d7a9e2和8d7a9h4，保藏号分别为cctccno：c202141和cctcc no：c202142，于2021年01月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为是，中国，武汉，武汉大学，经检测存活。

5、第二方面，本发明提供一种抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体由第一方面所述的产生抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。

6、第三方面，本发明提供第二方面所述的抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体的制备方法，所述单克隆抗体的制备方法包括：培养第一方面所述的产生抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进行分离纯化，获得所述抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体。

7、第四方面，本发明提供第二方面所述的抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体在制备用于人肝功能、人肝脏疾病及癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的试剂盒中的应用。

8、优选地，所述人肝脏疾病包括肝炎、脂肪肝、肝纤维化或肝硬化。

9、优选地，所述癌症包括肝癌、肺癌或乳腺癌。

10、优选地，所述试剂盒包含特异性检测样本中的akr1b10蛋白水平的试剂。

11、优选地，所述试剂盒还包含akr1b10蛋白标准品。

12、优选地，所述试剂盒检测的样本包括血清、血浆、尿液、脑脊液、腹水、乳汁、肠液、大便、唾液、阴道分泌物或组织样本中任意一种或至少两种的组合。

13、本发明中，使用所述试剂盒进行筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测包括：

14、(a)利用所述特异性检测akr1b10蛋白的试剂测量来自受试者的生物学样品中akr1b10蛋白的水平；

15、(b)将(a)中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。

16、本发明发现，akr1b10蛋白是一种分泌性的人醛酮还原酶，在健康人胃肠道上皮组织高表达，在肝脏组织中低表达，由于正常人胃肠道上皮和肝脏表达分泌的akr1b10蛋白均进入肠道排出，因此正常人血液中akr1b10蛋白浓度很低。

17、第五方面，本发明提供一种检测人醛酮还原酶1b10蛋白的酶联免疫吸附检测试剂盒，所述酶联免疫吸附检测试剂盒包含第二方面所述的抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体。

18、优选地，所述单克隆抗体为含有hrp标记的抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体。

19、优选地，所述酶联免疫吸附检测试剂盒还包含包被特异性捕获抗体的酶联免疫吸附测定板、包被缓冲液、样品稀释液、封闭液或洗脱液中的任意一种或至少两种的组合。

20、本发明中，所述酶联免疫吸附检测试剂盒包括：

21、包被特异性捕获抗体的酶联免疫吸附测定(elisa)板；包被缓冲液：1×pbs，ph7.3±0.1；样品稀释液：1×pbs、1-5％ bsa、0.05-1％ nan3，ph7.3±0.1；封闭液：1×pbs、3-5％ bsa；洗脱液pbst：1×pbs、0.05-0.06％ tween-20；用hrp标记的单克隆抗体。

22、第六方面，本发明提供一种检测人醛酮还原酶1b10蛋白的时间分辨免疫荧光分析试剂盒，所述时间分辨免疫荧光分析试剂盒包含第二方面所述的抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体。

23、优选地，所述单克隆抗体为含有生物素标记的抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体。

24、优选地，所述酶联免疫吸附检测试剂盒还包含包被特异性捕获抗体的时间分辨荧光免疫测定板、包被缓冲液、样品稀释液、封闭液、洗脱液或streptavidin-eu中的任意一种或至少两种的组合。

25、本发明中，所述时间分辨荧光免疫试剂盒(trfia)包括：

26、包被特异性捕获抗体的时间分辨荧光免疫测定(trfia)板；包被缓冲液：1×pbs，ph7.3±0.1；样品稀释液：1×pbs、1-5％ bsa、0.05-1％ nan3，ph7.3±0.1；封闭液：1×pbs、3-5％ bsa；洗脱液pbst：1×pbs、0.05-0.06％ tween-20；含有生物素(biotin)标记的单克隆抗体；streptavidin-eu。

27、第七方面，本发明提供一种检测人醛酮还原酶1b10蛋白的化学发光检测试剂盒，所述化学发光检测试剂盒包含第二方面所述的抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体。

28、优选地，所述单克隆抗体为含有化学发光标记物的抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体，所述化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、碱性磷酸酶或鲁米诺中任意一种。

29、优选地，所述化学发光检测试剂盒还包含包被有特异性捕获抗体的法学发光磁微粒、样品稀释液、洗脱液或发光底物中的任意一种或至少两种的组合。

30、本发明中，所述化学发光检测试剂盒包括：

31、包被有特异性捕获抗体的化学发光磁微粒；样品稀释液：1×pbs、1-5％ bsa、0.05-1％ nan3，ph7.3±0.1；洗脱液pbst：1bsts、0.05-0.06％ tween-20；含有化学发光标记物的特异性单克隆抗体；所述的化学发光标记物包括吖啶酯、三联吡啶钌、碱性磷酸酶、鲁米诺；发光底物试剂。

32、第八方面，本发明提供一种检测人醛酮还原酶1b10蛋白的免疫比浊检测试剂盒，所述免疫比浊检测试剂盒包含第二方面所述的抗人醛酮还原酶1b10蛋白单克隆抗体。

33、优选地，所述免疫比浊检测试剂盒还包含r1试剂、r2试剂、定标液或检测抗体中的任意一种或至少两种的组合，所述r1试剂由磷酸盐缓冲液、聚乙二醇和叠氮钠组成，所述定标液为人akr1b10抗原溶液，所述检测抗体为用全长akr1b10抗原免疫山羊或兔获得的多克隆抗体。

34、优选地，所述r1试剂中含tris缓冲液20-30mmol/l，聚乙二醇8000 5-15g/l和0.5-1％叠氮钠等，ph为8.2。

35、优选地，所述r2试剂中含特异性单克隆抗体2-15mg/ml和0.5-1％叠氮钠，ph为7.5。

36、优选地，所述定标液中人akr1b10抗原的浓度为0ng/ml、0.0625ng/ml、0.125ng/ml、0.25ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml或32ng/ml。

37、本发明建立的检测akr1b10蛋白的酶联免疫吸附法(elisa)、时间分辨荧光免疫法、化学发光法和免疫比浊法等方法的试剂盒，可适用于肝功能、肝脏疾病以及肝癌、肺癌和乳腺癌早期诊断和人群筛查、疗效判断、复发监测及预后评估等方面，具有快速、客观和准确性高等优点。

38、肝功能：人体akr1b10蛋白主要表达在胃肠道上皮细胞和肝细胞，胃肠道上皮细胞和肝细胞表达的akr1b10蛋白直接或间接通过胆道系统进入消化道，被排除体外；而当肝功能受损时，肝细胞产生的akr1b10蛋白则会进入血液，导致血清akr1b10蛋白浓度增加。

39、肝脏疾病：肝炎严重时，或者脂肪肝(包括酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪)形成后，或者演变成为肝纤维化或肝硬化后，肝细胞akr1b10蛋白表达增加，进入也血液增多。

40、癌症诊断：当肿瘤很小时，病人还没有临床症状，通过检测血清中akr1b10蛋白的改变，进行肝癌、肺癌和乳腺癌的早期诊断。

41、指导治疗：检测接受治疗的肝癌、肺癌及乳腺癌病人血清中akr1b10蛋白的改变，可判断疗效。

42、监测复发：定期检测已治疗的肝癌、肺癌及乳腺癌病人血清中akr1b10蛋白的改变，若升高则预示癌症复发。

43、判断预后：肝癌、肺癌及乳腺癌病人血清中akr1b10蛋白的水平与肿瘤的大小及转移、复发率和生存率有关，预示治疗效果及病人的预后。

44、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

45、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

46、(1)本发明针对人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1b10蛋白，开发出一种新的特异性单克隆抗体，本发明所述单克隆抗体的特异性好，与akr1b10蛋白具有较高的亲和力，与其他无关蛋白无交叉反应。

47、(2)本发明以所述单克隆抗体开发出一系列灵敏、特异、高效的诊断试剂盒，在包括酶联免疫吸附、时间分辨免疫荧光分析和化学发光检测等在内的多种检测中应用效果较好包括，可以广泛应用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。