猕猴桃感病基因及其适用的VIGS沉默体系构建

本发明属于基因工程，涉及一种猕猴桃vigs沉默体系的构建与应用，该体系适用于挖掘猕猴桃感溃疡病基因。

背景技术：

1、病毒诱导的基因沉默(virus-induced genesilencing，vigs)是一种rnai(rnainterference，rna干扰)下调基因的方法。携带目标基因片段的病毒侵染宿主，向下调控内源基因的表达水平并引起表型特征的变化，从而研究靶基因功能。trv(tobacco rattlevirus，烟草脆裂病毒)病毒寄主范围广泛，可以感染多种草本植物和作物，是目前vigs技术中应用最为广泛的病毒载体，改造后的病毒可以促进病毒序列的插入以及后续的感染，并且可以直接以宿主植物生长点的rna为目标，具有病毒症状轻、沉默效率高、持续时间长以及可感染宿主植物的分生组织等优点。八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoenedesaturase，pds)的cdna片段插入烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，tmv)并侵染烟草，发现植株呈漂白特征。该现象是一种基于核酸序列发生特异性互作的降解机制，为vigs体系的建立提供了很好的表征。

2、由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(pseudomonas syringae pv.actinidiae，psa)引起的溃疡病，导致花腐叶枯、枝干流脓甚至树死园毁，严重制约产业的健康可持续发展。种植抗病品种是防控溃疡病安全、绿色、持久、高效的方法，但目前生产上尚无对猕猴桃溃疡病免疫的品种。在植物与病原菌的互作过程中，感病基因被认为是病原菌成功侵染病原体所需的关键因素，因此也被认为是植物和病原体之间建立亲和互作关系所必须。感病基因是植物中广泛存在的能够参与促进植物感病或者支持病原与植物相容的基因。与抗病基因赋予寄主特异性的抗性不同，感病基因的丧失往往意味着植物与病原之间微妙的平衡被打破，产生的是类似于非寄主性的抗性表型。感病基因的缺失可以提供一个更加广谱的，持久的不易被病原克服的抗性，为创制抗病材料提供新思路和新途径。但是目前猕猴桃的感病基因尚未见报道，果树的感病分子机理研究进展缓慢，主要原因在于遗传转化效率低、瞬时转化技术不成熟。

3、pho1基因家族在植物中起着多种重要生物学功能，在拟南芥和水稻等模式植物中，pho1基因家族成员参与了一系列的生物学反应，如参与无机磷酸盐的转运、响应植物激素信号、参与各种胁迫及其信号转导途径、调控开花、下胚轴生长、子叶大小和种子大小等发育过程。至今为止，在猕猴桃中对该家族基因的研究未有报道。

技术实现思路

1、通过vigs沉默作物优良性状负调控基因、感病相关基因可快速实现猕猴桃重要经济性状的改良。本发明人团队在前期探究猕猴桃与猕猴桃溃疡病菌互作中发现，在溃疡病菌侵染的各个时间点，感病品种中acpho1的表达明显高于抗病品种，据此推测acpho1可能与猕猴桃的感病性相关，是候选的猕猴桃感病基因。在此基础上，本发明通过vigs系统来验证候选感病基因acpho1的感病性，通过沉默感病基因为创制持久、广谱抗病品种奠定基础。

2、为实现本发明的技术目的，本发明采用农杆菌介导的瞬时转化方法，对猕猴桃组培苗进行真空渗透侵染，结合目的基因的沉默效率和表型观察技术，对不同侵染浓度(od600＝0.5、1.0、1.5、2.0)、不同真空渗透压(0.04mpa、0.06mpa、0.08mpa、0.1mpa)及侵染后不同培养温度(16℃、22℃、25℃、28℃)进行优化，得到目的基因沉默的最优条件，以最优沉默体系对猕猴桃感病相关基因进行沉默，而后通过叶盘真空渗透法接种psa，通过统计病菌发病面积、生物量来验证体系的可行性。

3、本发明揭示一种猕猴桃基因acpho1。所述基因acpho1与猕猴桃溃疡病感病相关，编码区核苷酸序列如seq id no：1所示。经本发明验证，所述基因acpho1是一种新的猕猴桃感病基因，瞬时沉默猕猴桃感病基因acpho1后接种猕猴桃溃疡病菌，可以显著增强猕猴桃对细菌溃疡病的抗性，并且其病斑面积、生物量也有显著降低。

4、本发明进一步设计出猕猴桃感病基因acpho1特异性核苷酸序列，所述基因acpho1特异性核苷酸序列如seq id no：2所示。

5、对猕猴桃感病基因acpho1进行功能分析获知，沉默所述基因acpho1或所述基因acpho1特异性核苷酸序列，可以提高猕猴桃对溃疡病的抗性，减少丁香假单胞猕猴桃致病变种(pseudomonas syringae pv.actinidiae)在猕猴桃的定殖含量。

6、本发明进一步提供所述猕猴桃基因acpho1在增强猕猴桃对溃疡病抗性中的应用。通过沉默所述猕猴桃基因acpho1可以提高猕猴桃对溃疡病的抗性。作为本发明优选实施方式之一，通过沉默所述猕猴桃基因acpho1特异性核苷酸序列同样可以增强猕猴桃对溃疡病的抗性。

7、为了验证本发明的猕猴桃感病基因acpho1，本发明建立了一种操作简单、稳定高效适用于猕猴桃的vigs沉默体系。通过对不同侵染浓度、不同真空渗透压及侵染后不同培养温度进行优化，得到适用于所述猕猴桃基因acpho1功能分析的vigs沉默体系，即含有trv2-acpho1质粒的农杆菌侵染液od600为1，真空渗透0.1mpa侵染，25℃培养5d。

8、该vigs沉默体系的建立，为猕猴桃功能基因的研究奠定理论基础。本发明还给出所述vigs沉默体系在增强猕猴桃对溃疡病抗性中的应用。相对具体地，以所述vigs沉默体系对猕猴桃基因acpho1进行沉默。作为本发明优选实施方式之一，以所述vigs沉默体系对猕猴桃基因acpho1特异性核苷酸序列进行沉默，所述基因acpho1特异性核苷酸序列如seqid no：2所示。

9、基于本发明提供的猕猴桃的新感病基因acpho1，以及优化了的猕猴vigs沉默体系，本发明提供一种增强猕猴桃对溃疡病抗性的方法。该方法包括沉默所述基因acpho1或所述基因acpho1特异性核苷酸序列，所述基因acpho1编码区核苷酸序列如seq id no：1所示，所述基因acpho1特异性核苷酸序列如seq id no：2所示。

10、作为本发明优选实施方式之一，本发明所述增强猕猴桃对溃疡病抗性的方法，包括以vigs沉默体系对所述基因acpho1或所述基因acpho1特异性核苷酸序列进行沉默，所述vigs沉默体系为：含有trv2-acpho1质粒的农杆菌侵染液od600为1，真空渗透0.1mpa侵染，25℃培养5d。

11、与现有技术相比，本发明“猕猴桃感病基因及其适用的vigs沉默体系构建”具有下述的有益效果或优点。

12、(1)本发明挖掘出一种猕猴桃新感病基因acpho1，编码区核苷酸序列如seq idno：1所示。对猕猴桃感病基因acpho1或基因acpho1特异性核苷酸序列(seq id no：2)进行沉默，可以提高猕猴桃对溃疡病的抗性，减少丁香假单胞猕猴桃致病变种在猕猴桃的定殖含量。猕猴桃感病基因acpho1的发现为创制抗病材料提供新思路和新途径。

13、(2)本发明建立了一种周期短、无需遗传转化、操作简单且适用于猕猴桃基因功能研究的vigs体系。目前关于猕猴桃植株构建的vigs体系的应用很少有报道，本发明的设计囊括了整个猕猴桃植株并且从农杆菌侵染浓度、渗透压强、温度等角度进行优化。与其他研究方法相比，vigs技术可以直接作用于靶基因，验证基因功能周期短；对遗传转化困难、生长周期长的植物基因功能的研究非常有利；可以在植物幼苗、茎、叶、花、果实等多种器官中进行；可以特异性地沉默基因家族中单个或多个基因，解决基因家族冗余性的问题。

14、(3)本发明优化了猕猴vigs沉默体系。优化后的vigs沉默体系为：含有trv2-acpho1质粒的农杆菌侵染液od600为1，真空渗透0.1mpa侵染，25℃培养5d。通过最优沉默条件对猕猴桃感病基因acpho1进行瞬时沉默后接种猕猴桃溃疡病菌后，与对照相比显著增强了猕猴桃对细菌溃疡病的抗性，并且其病斑面积、生物量也有显著降低。