恢复HDAC1活性的新化合物制备方法及提高染色体稳定性应用

本发明涉及医药，特别涉及恢复hdac1活性的新化合物制备方法及提高染色体稳定性应用。

背景技术：

1、随着人们生活水平的不断提高，饮食结构及生活方式的变化，血管衰老相关的疾病(如动脉粥样硬化、冠心病、血管钙化等)的病例呈逐年上升趋势并严重威胁人类健康，尤其是老年人，血管老化使人因血管细胞显着功能障碍或衰老，血管结构和功能不适应而更易患心血管疾病。血管老化是一个复杂的生物学过程，其病理学特征是血管功能障碍和血管形态异常。目前没有简单的方法来了解血管衰老的整个过程，因此预防血管衰老相关疾病需要长期关注和不断干预。

2、目前常见的抗衰老药物，比如β-烟酰胺单核苷酸(β-nmn)，辅酶q10等成为临床上热捧的产品，β-烟酰胺单核苷酸(β-nmn)是通过促进损伤的dna修复来延缓衰老，辅酶q10通过改善线粒体的功能来延缓衰老的进程，而此类产品的均由国外的公司发明，相关的研究机制已经较为明确。为了更好地预防或治疗血管衰老疾病，迫切需要寻找更多的候选药物，而中医药可能会提供一些新的选择。

3、近年来，越来越多的证据表明表观遗传治疗策略在抑制血管疾病的发展和进展中起着至关重要的作用。表观遗传学是指在不改变原始dna序列的情况下影响基因表达的任何因素。它主要包括dna甲基化、组蛋白修饰和非编码rna调控。越来越多的研究表明，表观遗传修饰有望通过抑制细胞衰老或消除衰老细胞来逆转不同细胞的表型衰老变化，其中最有前景的机制之一就是通过稳定机体染色体的稳定性来促进基因的稳定转录和机体稳态。我国中药资源物产丰富，种类齐全，因此，从中药中挖掘有效的基于表观遗传的抗血管衰老药物具有广阔的前景。

4、附子是一种经典的中草药，为乌头侧根。在临床上使用附子有着悠久的传统。最早的记录出现在东汉，临床使用到现在已经有2000多年历史了，当时人们认为附子可以发挥回阳作用，有助于治疗突然阳脱的综合症。尽管一些研究集中在类风湿性关节炎、心血管疾病、肿瘤、皮肤伤口、抑郁、腹泻、肠胃炎和水肿，但附子最显著的不良反应是，其毒性比较大，这大大地限制了它的广泛使用。因此，集中研究中药的一种有效成分，将更有希望探索其临床价值。例如，从柳树皮中提取的阿司匹林已经发展成为一种经典的抗凝血剂，而紫杉醇是从红豆杉的树皮中分离出来的天然次生代谢物，它已被转化为一种化疗药物，用于治疗多种类型的癌症。可以说，中药小分子化合物的发现为新药的开发带来了广阔的前景，从而引发了人们对这些化合物在治疗疾病方面的生物学研究的极大兴趣。

5、目前附子虽然被发掘具有多种的治疗功效，其相关提取物也获得了相应的发明专利。然而目前没有发现有抗血管衰老的活性成分报道。另外，在中草药中也有许多具有抗衰老活性的小分子药物报道，然而，鲜有通过表观遗传调控方式起作用的。

技术实现思路

1、有鉴于此，有必要提供一种恢复hdac1活性的新化合物制备方法及提高染色体稳定性应用。本发明制备了一种能够恢复衰老血管内皮细胞中的hdac1、提高染色质稳定性的活性成分，并验证了其抗衰老活性。本发明旨在制备一种基于中医药的化学小分子，通过稳定基因组的水平，从而达到持续治疗血管衰老的效果。

2、一种恢复hdac1活性的新化合物制备方法，hdac1是一种去乙酰化转移酶，恢复hdac1活性的新化合物制备方法包括以下步骤：

3、步骤一，从数据库中筛选活性成分；

4、步骤二，从2～3月龄sd大鼠胸主动脉分离raecs；

5、步骤三，药物配制，去氧穿心莲内酯da母液用dmso配置成10mm/ml的药物，使用时稀释到相应的浓度；

6、步骤四，体外衰老模型的建立与mrna水平检测；

7、步骤五，体外衰老模型的建立与使用蛋白免疫印迹法检测蛋白水平变化；

8、步骤六，免疫荧光检测；

9、步骤七，以口服生物利用度和药物相似度作为筛选标准，提取化合物进行抗衰老活性的筛选，经过基因表达和蛋白表达双重校验，获得去氧穿心莲内酯作为抗衰老药物的候选分子，从而获得恢复hdac1活性的新化合物。

10、优选的，步骤一中，从tcmsp中药系统药理学数据库与分析平台进行口服生物利用度和药物相似度筛选活性成分，其中口服生物利用度ob≥30％，药物相似度dl≥0.3；

11、步骤二中，从2～3月龄sd大鼠胸主动脉分离raecs，具体方法为：前3代raecs培养于内皮培养基ecm，其中内皮培养基ecm由培养液、浓度为5％胎牛血清fbs和浓度为1％内皮细胞生长补充剂ecgs组成；第三代后培养于混合培养液中，混合培养液由培养基dmem、浓度为20％胎牛血清fbs和浓度为1％青霉素/链霉素混合而成；细胞在37℃、浓度为5％ co2的湿气培养箱中培养备用。

12、优选的，步骤四中，体外衰老模型的建立与mrna水平检测的具体方法为：给予血管紧张素ii刺激raecs、hemc-1、bcecs细胞至少48小时，造成衰老标志物的上调，提取rna进行体外衰老标志物的检测；总rna用trizol试剂分离；每个样品约1μg总rna被反转录为cdna，然后使用ultrasybr混合液进行聚合酶链式反应pcr。

13、优选的，步骤五中，体外衰老模型的建立与使用蛋白免疫印迹法检测蛋白水平变化，具体方法为：给与血管紧张素ii刺激raecs、hemc-1、bcecs细胞至少48小时，细胞在加入1mm苯甲基磺酰氟的冰冷ripa缓冲液中裂解；蛋白质在4℃下以12000rpm离心15分钟获得；等量的10μg蛋白加载到浓度为10-15％ sds-page单元上，通过电印迹转移到硝化纤维素nc膜上；nc膜用5％脱脂奶粉再封闭，用1∶1000稀释的一抗染色，然后在4℃孵育过夜；然后用过氧化物酶偶联二抗体在1:10000稀释下检测细胞膜；然后用增强化学发光试剂检测抗原-抗体复合物，使用amershamersham image quant 800系统进行可视化，并使用image j软件进行分析。

14、优选的，步骤六中，免疫荧光检测，具体检测方法为：raecs在96孔板上过夜，随后用ang ii和da处理，处理48小时后，细胞用2％多聚甲醛固定15分钟，然后用0.2％ tritonx-100在pbs中渗透20分钟；raecs用浓度为1％牛血清白蛋白bsa在tbst中封闭1小时，并与一抗在4℃孵育一夜，次日加入适量二抗，室温孵育2h，细胞核用dapi染色0.5小时；使用incell analyzer 6000捕获图像；

15、步骤七中，以口服生物利用度ob≥30％和药物相似度dl≥0.3作为筛选标准，从tcmsp中提取化合物进行抗衰老活性的筛选。

16、一种恢复hdac1活性的新化合物提高染色体稳定性的应用，恢复hdac1活性的新化合物应用于血管内皮细胞的抗衰老，可提高染色体稳定性。

17、优选的，恢复hdac1活性的新化合物提高染色体稳定性的应用中，药物靶点的虚拟筛选与药物稳定染色质的验证方法：

18、步骤1)，虚拟筛选，预测da的药理靶点，通过数据库筛选血管衰老的病理靶点；

19、步骤2)，药物靶点验证：

20、a).进行生物层干涉测定bli，进一步确认所选靶点；

21、b).进行蛋白免疫印迹法验证靶点hdac1的变化；

22、c).进行蛋白免疫印迹及免疫荧光方法检测染色体活跃性标志物h3k4me3的表达；h3k4me3高表达的细胞，其染色质相对活跃并且不稳定，然而给予筛选的活性药物分子后，该染色质活跃标志物的蛋白表达水平发生了显著的下降，因此，可以认定，去氧穿心莲内酯具有稳定染色质的功能活性。

23、3)药物毒性评价：在raecs和hmec-1细胞中检测去氧穿心莲内酯的毒性。

24、优选的，步骤1)中，虚拟筛选，利用swiss target prediction data-base预测da的药理靶点，genecards或者disgenet数据库筛选血管衰老的病理靶点，利用cytoscape3.8.0软件对两者的交集进行可视化处理。

25、优选的，步骤2)中，药物靶点验证：a).使用octet red96进行生物层干涉测定bli进一步确认所选靶点；流程为：仪器振动速度为1000转/分，板温为30℃；50μg/ml hdac1-his-tag蛋白加载在octet ni-nta生物传感器上；生物素标记的hdac1蛋白装载在超级链霉亲和素ssa生物传感器上；背景控制使用相同的传感器孵育在磷酸盐缓冲液pbs动力学缓冲液中，不含蛋白质；每一测定孔含有200μl dapbs稀释的溶液，然后添加到一个黑色的聚丙烯96孔微板，其余孔填充pbs；生物传感器浸在含有不同浓度da的孔中与药物相结合120-180s，然后进行分离120-180s，所有数据使用octet 9.0版本数据分析软件进行分析；报告kd、kon、koff和r2值。

26、优选的，步骤3)中，药物毒性评价：在raecs和hmec-1细胞中检测去氧穿心莲内酯的毒性，发现其在200μm以内没有毒性，提示其ic50大于200μm，故而其安全性目前与市场上的β-nmn相似；

27、恢复hdac1活性的新化合物提高染色体稳定性的应用中，基于crispr/cas9的基因编辑细胞株raecs和bcecs的建立及其在药物评价中的作用：基于crispr/cas9的基因编辑hdac1基因失活稳定表达细胞株的建立；靶向hdac1的sgrna的序列为:acttgatgtagtcgtcgctg；25ng质粒经过转化进入冰中溶解的stbl3感受态中，静置半小时，随后42℃，热激90秒，迅速插入冰中静置2分钟；随后加入lb培养基1ml，并在180rpm摇床中摇45分钟进行感受态细胞活化；随后，3000rpm离心5分钟，弃掉上清；用培养基重悬；取菌液在含有100μg/ml具有氨苄青霉素钠的琼脂糖平板中过夜筛选；次日挑选单克隆团进行进一步扩大培养；培养所获得的大肠杆菌经过质粒抽提试剂盒得到质粒；

28、用pmd2.g、pspax.2和目的质粒在hek 293t中使用lipofectamine 2000转染试剂thermo fisher scientific进行转染；48小时后通过嘌呤霉素筛选纯化hdac1敲除细胞raecs和bcecs；纯化后的细胞经过rt-pcr和蛋白免疫印迹法检测hdac1的基因水平表达和蛋白水平表达；ros检测，采用非荧光探针2'，7'-二氯荧光素二乙酸dcfh-da进行检测；dcfh-da很容易扩散到细胞内，然后被酯酶脱乙酰转化为不溶性的非荧光2'，7'-二氯荧光素(dcfh)；在ros存在的情况下，dcfh与ros反应形成荧光产物dcf，dcf被困在细胞内；raecs或其他细胞及其hdac1敲除细胞以5×104/孔的密度接种于96板；播种后1天，用2μmang ii和不同剂量的da溶液处理培养孔24h；先除去培养液，用pbs洗涤3次，获得分离的小胶质细胞用于ros试验；加入无血清培养液稀释至终浓度10μm的dcfh-da，37℃孵育20min；用incell analyzer 6000平板阅读器在488nm下读取荧光；荧光强度指示细胞内ros含量。

29、本发明通过对比在正常的血管内皮细胞和hdac1敲除的血管内皮细胞中ros的含量来证明药物在hdac1敲除后能否起作用，以此证明药物释放是否依赖该靶点起抗衰老作用。

30、蛋白免疫印迹法评价hdac1敲除株中衰老标志物γ-h2a.x的含量。本发明通过对比在正常的血管内皮细胞和hdac1敲除的血管内皮细胞中γ-h2a.x的下降情况来证明药物在hdac1敲除后能否起作用，以此证明药物释放是否依赖该靶点起抗衰老作用。

31、本发明所述的方法具有较高的抗衰老活性及较低的毒性，其是通过hdac1的调控起主要作用，hdac1是一种去乙酰化转移酶，其活性的提高会降低染色质的活性，并以h3k4me3作为评价指标。我们从附子中挖掘的成份，去氧穿心莲内酯da对血管内皮的衰老具有较好的治疗效果。

32、(1)毒性小。da在24小时的时间点在raecs和hmec-1中的细胞活力测定结果表明，da在200μm以下无毒性。因此可以说明其ic50在200μm以上。故而毒性是非常小的。

33、(2)其在细胞水平上的疗效：为了评估da是否能够缓解内皮细胞衰老，我们用2μm剂量的ang ii刺激raecs或hmec-1细胞系48h，并引起衰老表型。以抑制衰老的生物标志物在mrna水平或蛋白水平上作为判断化合物是否具有降低衰老标志物作为评价标准。我们将raecs和hmec-1细胞暴露于ang ii，发现衰老生物标志物水平升高。我们选择了50μm、100μm和150μm的da浓度来评估其效果。ang ii显著增加了raecs和hmec-1中p21和p16的mrna水平，而da治疗抑制了ang ii诱导的这些基因的表达升高，其mrna水平的抑制效果在2倍以上。接下来，我们检测了p53、γ-h2a、p21中衰老生物标志物的蛋白质水平，结果也显示在蛋白水平有治疗效果。da处理的细胞可以降低ang ii暴露引起的衰老生物标志物水平的升高。这些结果表明，da在mrna和蛋白水平上降低了ang ii诱导的内皮细胞衰老表型。研究数据见
技术实现要素：
。

34、(3)提高染色体稳定性的应用。在确定药物的疗效之后，我们制备了25μm，50μm、100μm和150μm的去氧穿心莲内酯da，发现在50μm、100μm和150μm浓度范围内去氧穿心莲内酯能够降低ang ii诱导的染色质不稳定(即h3k4me3的水平显著上调)，且呈药物浓度依赖性，故而可以发现去氧穿心莲内酯具有稳定染色质的活性。

35、(4)用于药物靶点验证的crispr/cas9诱导的hdac1的基因编辑效率分析。在药物的疗效得到确认之后，我们需要验证其与作用靶点的关系。故而我们在raecs中使用crispr/cas9介导的hdac1敲除，分别通过q-pcr和western blot检测60％mrna和56.8％蛋白质敲除效率，hdac1的功能缺失导致da抗衰老能力的消失。从ros检测结果来看，50μm、100μm和150μm的da显著降低了ros的积累。然而，hdac1的敲除显示ros失活没有明显变化。western blot检测γ-h2a.x获得的结果也相似。在没有hdac1的情况下，药物不能发挥抗衰老作用。而阳性对照，即烟酰胺单核苷酸(nmn)在ang ii诱导模型(降低ros和γ-h2a.x)中仍能发挥抗衰老作用，原因是它影响了许多与衰老相关的途径，如线粒体产生能量的代谢途径、氧化应激、dna修复、染色质重塑等。由此可见，da能够显著抑制基于hdac1的血管内皮细胞的衰老表型。研究数据见发明内容。

36、(5)在体内的治疗效果。在离体后，外周血细胞逐渐衰老或死亡。mrna水平显示衰老生物标志物的升高。我们使用rt-pcr检测腹主动脉穿刺采集的外周血中的衰老标志物p16和p21在0h、1h、3h、5h、7h、9h的表达情况。从人体分离出血液后，p16和p21的表达明显增加。当50μm、100μm和150μm的da处理全血4小时或8小时时，p16和p21的衰老生物标志物下降。这些证据与临床知识相一致，暗示了附子能用于挽救濒死生命的原因可能是其有效成分da在降低衰老生物标志物方面起着关键作用。

37、有益效果：

38、本发明采用具有中医药研究常用网络药理学挖掘结合药理学科研实验，逐层筛选关键活性小分子，同时采用前沿的技术如bli(bio-layeri nterferometry)、crispr-cas9等技术逐步进行相关研究，研究开发了毒性小，具有表观遗传调控活性的关键小分子，从而达到抗血管衰老的治疗效果，具有重要的应用价值。本发明所述的方法具有较高的抗衰老活性及较低的毒性，其是通过hdac1的调控起主要作用，hdac1是一种去乙酰化转移酶，其活性的提高会降低染色质的活性，并以h3k4me3作为评价指标。我们从附子中挖掘的成份，去氧穿心莲内酯da对血管内皮的衰老具有较好的治疗效果。