一种利用赤霉菌转化黄体酮生成11α,17α-diOH-黄体酮的方法

本发明属于生物，具体涉及一种利用赤霉菌(gibberella intermedia)ca3-1转化黄体酮生成11α，17α-dioh-黄体酮的方法。

背景技术：

1、黄体酮又称孕酮、黄体激素，是合成甾体皮质激素与甾体孕激素药物的重要中间体，可以用来合成氢化可的松，醋酸孕酮，醋酸可的松，倍他米松，氯地孕酮，甲地孕酮等甾体激素类药物。在生物体内，黄体酮能被羟基化成不同的产物，其中报道较多的是11α-dioh-黄体酮可用于合成氯地孕酮等这类孕激素药物，而对其11α，17α-dioh-黄体酮产物报道较少。

2、甾体化合物的制备方法主要有传统的化学合成方法，及目前较常使用的微生物转化法。与传统的化学合成方法相比，微生物的生物转化具有反应步骤少、条件温和、规模生产，以及不污染环境等众多优势。利用微生物转化技术，可选择性的在黄体酮的母核中引入一个或多个羟基位点，从而合成多种甾体药物的中间体，用于生产多种抗炎药物。由于甾体化合物独特的生物活性和药用价值，国家已经把甾体激素药物开发作为医药行业近期技术发展的方向和重点之一。

3、近些年来，科研工作者已经找到了多株对黄体酮具有转化能力的菌株，如葡枝根霉(glucophyllum rhizomyces)、蓝色犁头霉菌(absidia coerulea)及黑根霉(rhizopusnigricans)等，其均能高效转化17α-黄体酮为11α，17α-dioh-黄体酮，但未见转化生成11α，17α-dioh-黄体酮的报道。

技术实现思路

1、发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种利用赤霉菌转化黄体酮生成11α，17α-dioh-黄体酮的方法，本发明利用赤霉菌(gibberella intermedia)ca3-1直接转化黄体酮为11α，17α-dioh-黄体酮。11α，17α-dioh-黄体酮的合成为甾体药物及其中间体的研究提供了更多元化的前体，而且c11α、c17α双羟化反应作为一种新的甾体羟化反应类型，为甾体药物合成开辟了新的途径，具有一定的研究价值和市场意义。

2、技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、本发明的目的在于提供一种新型的黄体酮双羟基化产物(11α，17α-dioh-黄体酮)以及其转化合成方法。通过一步转化法，利用赤霉菌(gibberella intermedia)ca3-1转化底物黄体酮为11α，17α-dioh-黄体酮。该菌保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.4903，保藏日期为2011年5月24日，分类命名为gibberella intermedia。

4、本发明的第一个目的是，提供一种利用赤霉菌转化黄体酮生成11α，17α-dioh-黄体酮的方法，包括将赤霉菌cgmccno.4903经活化培养和发酵培养后得菌种发酵液，所述菌种发酵液用于将底物黄体酮生物转化生成11α，17α-dioh-黄体酮。

5、在本技术中，所述赤霉菌为赤霉菌(gibberella intermedia)ca3-1，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.4903，保藏日期为2011年5月24日，分类命名为gibberellaintermedia。

6、可选的，在本技术的一种实施例中，所述底物黄体酮的浓度为1～5g/l。

7、可选的，在本技术的一种实施例中，所述底物黄体酮的浓度为3g/l。

8、可选的，在本技术的一种实施例中，所述转化过程包括，底物黄体酮加入到赤霉菌的菌体发酵液中，在转化温度28℃，200～220r/min转速下转化48～72h，即得转化液。

9、可选的，在本技术的一种实施例中，所述底物黄体酮加入到赤霉菌的菌体发酵液中包括，将菌种发酵液中培养好的菌体用0.1-0.5m pbs缓冲液洗涤，然后重悬于新鲜的30ml/250ml pbs缓冲液，制备赤霉菌ca3-1菌株的静息细胞，再将底物黄体酮投入所述赤霉菌ca3-1菌株的静息细胞中。

10、可选的，在本技术的一种实施例中，所述活化培养包括，将赤霉菌cgmcc no.4903作为生产菌种，在25～35℃、150～220r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到pda固体培养基上；挑取所述pda固体培养基上的ca3-1菌株一环，接种于种子培养基中，在25～35℃、150～220r/min条件下培养12～20h至对数生长中后期，即得到ca3-1菌株的种子培养液。

11、可选的，在本技术的一种实施例中，所述pda固体培养基的成分包括：土豆200～500g/l、葡萄糖20～50g/l、酵母粉2～10g/l、琼脂粉10～20g/l，调ph至6.5～7.5，在121℃高压蒸汽下灭菌15～20min。

12、可选的，在本技术的一种实施例中，所述种子培养基的成分包括：葡萄糖10～30g/l，酵母粉5～15g/l，nacl 0.5～2g/l，kh2po4 1～5g/l，调ph至6.5～7.5，121℃高压蒸汽灭菌15～20min。

13、可选的，在本技术的一种实施例中，所述发酵培养包括，将种子液以体积百分比4％～8％的接种量接种于发酵培养基，装液量为250ml锥形瓶中装25～50ml发酵培养基，培养温度25～35℃，在150～220r/min转速下培养20～24h，得发酵液；

14、可选的，在本技术的一种实施例中，所述发酵培养基的成分包括：葡萄糖10～30g/l，酵母粉5～15g/l，玉米浆1～5g/l，nacl 1～5g/l，调ph至6.5～7.5，121℃高压蒸汽灭菌15～20min。

15、可选的，在本技术的一种实施例中，采用上述微生物转化黄体酮为11α，17α-dioh-黄体酮的方法，其具体步骤如下：

16、(1)以赤霉菌ca3-1为生产菌株，25～35℃，150～220r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到pda平板上；

17、(2)制备ca3-1菌株的细胞液体培养物：挑取步骤(1)的pda固体培养基上的ca3-1菌株一环，接种于已灭菌的装有50～100ml种子培养基的500ml锥形瓶中，培养温度为25～35℃，置摇床上以180～220r/min的转速培养12～20h至对数生长中后期，即得到ca3-1菌株的种子培养液；

18、(3)发酵培养：将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以4％～8％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，装液量为250ml锥形瓶中装25～50ml发酵培养基，相同条件下培养20～24h，得菌体发酵液；

19、(4)生物转化：将步骤(3)中培养好的菌体用0.1-0.5m pbs缓冲液洗涤，然后重悬于新鲜的30ml/250ml pbs缓冲液，制备赤霉菌ca3-1菌株的静息细胞。准确称取适量的底物黄体酮，投入赤霉菌ca3-1菌株的静息细胞中，使其终浓度为1～5g/l，在转化温度28℃，200～220r/min的转速下转化48～72h，即得转化液。

20、本技术的第二个目的是，提供以上方法制备得到的11α，17α-dioh-黄体酮。

21、可选的，在本技术的一种实施例中，如图1，11α，17α-dioh-黄体酮具有以下结构式：

22、本技术中，黄体酮转化为11α，17α-dioh-黄体酮的反应式如图2：

23、

24、有益效果：本发明提供的一种利用赤霉菌转化黄体酮生成11α，17α-dioh-黄体酮的方法，利用赤霉菌(gibberella intermedia)ca3-1直接转化黄体酮为11α，17α-dioh-黄体酮。11α，17α-dioh-黄体酮的合成为甾体药物及其中间体的研究提供了更多元化的前体，而且c11α、c17α双羟化反应作为一种新的甾体羟化反应类型，为甾体药物合成开辟了新的途径，具有一定的研究价值和市场意义。