一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于检测探针技术领域，尤其涉及一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肝细胞癌(hcc)是全球致死率第三高的恶性肿瘤，严重威胁人类生命和健康。一般认为，早期准确检测出hcc可改善患者的预后和生存。羧酸酯酶(carboxylesterase,ces)是一组多家族丝氨酸酯酶，能有效催化羧酸酯类、氨基甲酸酯类、酰胺类、硫酯类等外源物质的水解。特别是，ces已被证明是hcc的重要生物标志物，因为其表达水平与恶性程度密切相关。因此，寻找一种具有高灵敏度和高特异性的ces检测新方法可能是早期诊断肝脏疾病严重程度或存在的有效工具。
3.迄今为止，荧光探针以其灵敏度高、成本低、操作方便、时空分辨率高等独特特性在分子和细胞水平的生理病理监测中发挥着越来越重要的作用。小荧光探针一般由三部分组成：荧光基团、识别基团及连接链。荧光团通过激发而发射荧光信号以标记目标分子，识别基团与目标生物分子选择性结合，连接链用于连接识别基团与荧光团。因此，大量研究报道了用小荧光探针来检测羧酸酯酶。虽然使用可激活的荧光探针在检测ces领域进行了一些研究，但ces的主要识别部分仍然使用酯键，这可能会与乙酰胆碱酯酶(ache)和丁酰胆碱酯酶(bche)的底物存在潜在的相互干扰，从而干扰ces活性的准确检测。
4.近年来，肿瘤诊疗一体化已成为肿瘤治疗的新途径。为了实现高效、精准、无创的治疗，一系列光敏剂(ps)被开发用于图像介导的光疗。尼罗蓝衍生物硫代尼罗蓝enbs作为一种阳离子光敏剂，已经应用于光动力治疗。由于它能够通过i型光反应产生足够的超氧阴离子并且部分生成的超氧阴离子可通过超氧化物歧化酶(sod)介导的歧化反应、以及fenton反应转化为h2o2和剧毒的羟自由基(oh
·
)，以增强对癌细胞的损伤作用。此外，尼罗蓝具有水溶性、近红外发射、高荧光量子产率和低细胞毒性等优异性能，使其成为适合生物成像的荧光团。这些特性使enbs成为肿瘤诊断和治疗的良好候选荧光团。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于ces检测和肝癌治疗的近红外(nir)荧光探针，可进一步反映活细胞内ces的活性。
6.本发明提供的荧光探针优选的以2-氯苯二甲基氨基甲酸酯作为ces的水解位点和淬灭剂连接到enbs上。在与ces反应后，enbs的释放通过三个自发的步骤进行。这种生物转化导致enbs的荧光发射急剧增加。同时，该荧光探针可在激光照射下通过pdt产生对癌细胞具有高度毒性的活性氧(ros)，达到综合诊疗的目的。本发明提供的荧光探针为肝癌的体外监测和治疗提供了一种新的工具。
7.本发明提供了一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针，所述荧光探针的结构通式如式i所示：
[0008][0009]
其中r1为羟基、卤素、烷基或烷氧基的单取代；r2为识别基团。
[0010]
优选的，所述r2为甲酸酯、乙酸酯或氨基甲酸酯。
[0011]
优选的，所述荧光探针的结构式如式ii所示：
[0012][0013]
本发明提供了所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
1)将硫酸铝水溶液与n,n-二乙基-对苯二胺混合，然后依次加入硫代硫酸钠和氯化锌，反应后冷却得到第一反应混合物，向所述第一反应混合物中添加重铬酸钾水溶液，冰浴，得到第二反应混合物，加热回流第二反应混合物得到式iii所示化合物；
[0015][0016]
2)将1-萘胺、式iii所示化合物与第一有机溶剂混合，进行第一回流获得第一回流液，将碳酸银与第一回流液混合，进行第二回流得到式iv所示化合物；
[0017][0018]
3)在惰性气体保护下，将式iv化合物、n,n-二异丙基乙胺和三光气在第二有机溶剂中搅拌1～3h，获得混合物溶液，所述混合物溶液在惰性气体保护下，80～90℃回流10～12h后，加入式v所示化合物搅拌10～12h，得到式ii所示化合物；
[0019][0020]
优选的，步骤2)中所述第一有机溶剂为醇类溶剂。
[0021]
优选的，步骤3)中所述第二有机溶剂为无水二氯甲烷。
[0022]
优选的，步骤2)中所述第一回流的温度为68～72℃，所述第一回流的时间为3～5h；所述第二回流的温度为68～72℃，所述第二回流的时间为3～5h。
[0023]
本发明还提供了所述的荧光探针在制备羧酸酯酶检测试剂中的应用。
[0024]
本发明还提供了所述的荧光探针在制备肝癌体外监测试剂中的应用。
[0025]
本发明还提供了所述的荧光探针在制备肿瘤光动力治疗药物中的应用。
[0026]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的荧光探针本身由于pet效应不发出荧光，当与羧酸酯酶反应后，氨基甲酸酯结构水解释放出羟基，进一步氯代苯环结构发生自消除，荧光团部分重新恢复荧光，从而实现对羧酸酯酶的特异性检测，为肝癌的体外监测和治疗提供了一种新的工具。
[0027]
根据实施例的记载，本发明提供的荧光探针能够测定ces且在高表达ces的hepg-2细胞中荧光强度更强，在与ces抑制剂bnpp孵育后，荧光强度减弱，说明本发明提供的荧光探针可用于ces的检测，在ces相关的生理病理及相关疾病的研究有广阔的应用前景。
附图说明
[0028]
图1为本发明提供的式ii所示的荧光探针cep1的合成路线图；
[0029]
图2为羧酸酯酶ces激活荧光探针cep1的机制示意图；
[0030]
图3为在有或没有羧酸酯酶ces(1u/ml)存在的情况下，荧光探针cep1(5μm)在pbs(ph 7.4)中的吸收(a)和荧光发射(b)光谱；
[0031]
图4为荧光探针cep1在黑暗或光照条件下对hepg-2细胞和hl-7702细胞的细胞毒性作用；
[0032]
图5为荧光探针cep1(10μm)在活细胞hl-7702和hepg-2细胞中于0.5h和1h时间点的荧光成像；bnpp组:用bnpp(100μm)预处理hepg-2细胞30min，然后与荧光探针cep1(10μm)孵育1h，λex＝633nm，λem＝670～780nm；比例尺:20μm。
具体实施方式
[0033]
本发明提供了一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针，所述荧光探针的结构通式如式i所示：
[0034][0035]
其中r1为羟基、卤素、烷基或烷氧基的单取代；所述r1优选为氯；r2为识别基团。
[0036]
在本发明中，所述r2优选为氨基甲酸酯，所述荧光探针的结构式优选的如式ii所示：
[0037][0038]
本发明提还供了式ii所示荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0039]
1)合成中间体1—式iii所示化合物
[0040]
将硫酸铝水溶液与n,n-二乙基-对苯二胺混合，然后依次加入硫代硫酸钠和氯化锌，反应后冷却得到第一反应混合物，向所述第一反应混合物中添加重铬酸钾水溶液，冰浴，得到第二反应混合物，加热回流第二反应混合物得到式iii所示化合物；
[0041][0042]
在本发明中，所述硫酸铝水溶液的浓度优选为260～280mmol/l，进一步优选为265～275mmol/l，更进一步优选为269mmol/l；在本发明中，每100ml的硫酸铝水溶液与4～6g的n,n-二乙基-对苯二胺混合，优选为4.5～5.5g，更优选为5g；所述硫代硫酸钠和氯化锌的添加量，以硫酸铝水溶液的体积计，每100ml的硫酸铝水溶液添加硫代硫酸钠14～14.5g，优选为14.2g；添加氯化锌3.5～3.7g，优选为3.6g。本发明所述冷却优选的在冰浴中进行，所述冰浴的时间优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h。
[0043]
本发明在获得所述第一反应混合物后，向所述第一反应混合物中添加重铬酸钾水溶液；所述重铬酸钾水溶液的浓度优选为0.03～0.05g/ml，进一步优选为0.04g/ml，所述重铬酸钾水溶液与第一反应混合物的体积比优选为1：(1.8～2.2)，进一步优选为1：(1.9～2.1)。在本发明中，所述冰浴的过程中伴随搅拌，所述冰浴的时间优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h；所述冰浴结束后，反应体系中出现沉淀；本发明优选的进行过滤，并用丙酮洗涤滤饼；本发明将获得的残余物置于甲醇中加热回流，所述加热回流的温度优选为70℃，所述加热回流的时间为3～5h，优选为4h；将回流后的液体冷却并过滤获得灰色固体即为式iii所示化合物。
[0044]
2)合成中间体2—式iv所示化合物
[0045]
将1-萘胺、式iii所示化合物与第一有机溶剂混合，进行第一回流获得第一回流液，将碳酸银与第一回流液混合，进行第二回流得到式iv所示化合物；
[0046][0047]
在本发明中，所述1-萘胺、式iii所示化合物与第一有机溶剂的质量体积比优选为(1.8～2.2)g：(7.6～8.0)g：40ml，进一步优选为(1.9～2.1)g：(7.7～7.9)g:40ml；更进一步优选为2.0:7.8:40ml。在本发明中，所述第一回流的温度优选为68～72℃，进一步优选为70℃；所述第一回流的时间优选为3～5h；本发明在所述第一回流结束后将碳酸银与第一回
流液混合，进行第二回流得到式iv所示化合物。在本发明中，所述碳酸银的质量，以原料1-萘胺计，为原料1-萘胺质量的3.8～3.9倍，进一步优选为3.85倍。在本发明中，所述第二回流的温度优选为68～72℃，进一步优选为70℃，所述第二回流的时间优选为3～5h。
[0048]
本发明在所述第二回流结束后优选的进行冷却，本发明在所述冷却后，进行过滤蒸发获得深蓝色固体即为式iv所示化合物。在本发明中，优选的还包括进一步纯化式iv所示化合物的步骤；具体包括将所述深蓝色固体与ch2cl2混合，用饱和碳酸钠洗涤；然后经无水mgso4干燥合并的有机层，过滤并用浓盐酸酸化；通过柱色谱(硅胶，梯度ch2cl2/meoh)纯化获得纯化的产物。在本发明中，所述ch2cl2的体积与原料式iii所示化合物的质量比优选为30ml：(7.6～8.0)g，进一步优选为30ml：(7.7～7.9)g，更进一步优选为30ml：7.8g。
[0049]
3)合成式ii所示化合物
[0050]
在惰性气体保护下，将式iv所示化合物、n,n-二异丙基乙胺和三光气在第二有机溶剂中搅拌1～3h，获得混合物溶液，所述混合物溶液在惰性气体保护下，80～90℃回流10～12h后，加入式v所示化合物搅拌10～12h，得到式ii所示化合物；
[0051][0052]
在本发明中，所述惰性气体优选为氮气或氩气；所述第二有机溶剂优选为无水二氯甲烷；在本发明中，所述式iv所示化合物、n,n-二异丙基乙胺和三光气的比例优选为180～190mg：0.7～0.9ml：320～340mg；进一步优选为185mg：0.8ml：330mg；在第二有机溶剂中搅拌的时间优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h。在本发明中，所述式v所示化合物与所述iv所示化合物的比例为(125～135)：(180～190)，进一步优选为(128～132)：(182～188)，更进一步优选为130:185。本发明在所述反应结束后，优选的进行冷却和蒸发，进一步优选的，在所述冷却和蒸发后通过柱层析纯化，所述柱色谱优选为硅胶柱，采用梯度ch2cl2/meoh进行纯化。
[0053]
本发明还提供了所述的荧光探针在制备羧酸酯酶检测试剂中的应用。
[0054]
本发明还提供了所述的荧光探针在制备肝癌体外监测试剂中的应用。
[0055]
本发明还提供了所述的荧光探针在制备肿瘤光动力治疗药物中的应用。
[0056]
本发明提供的所述荧光探针能够用于检测细胞中的羧酸酯酶；同时，该荧光探针可在激光照射下通过pdt产生对癌细胞具有高度毒性的活性氧(ros)，达到综合诊疗的目的；能够实现上述应用。
[0057]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0058]
实施例1
[0059]
荧光探针cep1的制备
[0060]
具体合成路线如图1所示。
[0061]
(1)中间体1的制备
[0062]
向硫酸铝(9.2g,26.9mmol)水溶液(100ml)中添加n,n-二乙基-对苯二胺(5.0g,
30.4mmol)。然后依次加入硫代硫酸钠(14.2g,57.3mmol)和氯化锌(3.6g,25.7mmol)，将反应混合物置于冰浴中冷却2h。随后缓慢加入重铬酸钾水溶液50ml(2.0g,6.8mmol)。此后，将反应溶液在冰浴中搅拌2h，出现一些沉淀。然后，将溶液过滤并用丙酮洗涤滤饼，所得残余物在meoh(80ml)中回流1h。随后，将溶液冷却至室温并过滤，得到产率为93％的灰色固体(式iii所示化合物)。该产品直接用于下一步。
[0063]
(2)中间体2的制备
[0064]
将1-萘胺(2.0g,14mmol)与化合物1(7.8g,25mmol)于40ml meoh中70℃下回流4h。然后，将碳酸银(7.7g,28mmol)缓慢添加到反应混合物中，在70℃下回流4h。冷却后，将所得溶液过滤蒸发，得到深蓝色固体。然后，添加ch2cl2(30ml)，用饱和碳酸钠溶液洗涤。经无水mgso4干燥合并的有机层，过滤并用0.4ml浓盐酸酸化。通过柱色谱(硅胶，梯度ch2cl2/meoh)纯化所得产物，获得18％产率的深蓝色固体(式iv所示化合物)。核磁共振氢谱检测结果如下：
[0065]1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δppm:9.53(br,2h),8.91(s,1h),8.43(s,1h),7.92(br,2h),7.82(s,2h),7.28(br,2h),6.99(s,2h),3.61(q,j＝8.0hz,4h),1.19(t,j＝8.0hz,6h).
[0066]
(3)中间体3的制备
[0067]
在室温下将3-氯-4-羟基苯甲醛(10mmol)、二甲基氨甲酰氯(11mmol)和tea(15mmol)于干燥ch2cl2(30ml)中的混合物搅拌12h。然后，将溶液冷却到室温，在真空中蒸发。通过柱层析(硅胶，梯度pe/ea)纯化所得混合物，获得81％产率的白色固体(图1中的3)。核磁共振氢谱检测结果如下：
[0068]1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δppm:10.21(s,1h),7.41(s,1h),7.24(br,1h),7.20(s,1h),3.04(s,3h),2.88(s.3h).
[0069]
(4)中间体4的制备
[0070]
在0℃下将中间体3(图1中的3)(2.3g,10.10mmol)和硼氢化钠(0.76g,20.20mmol)加入到圆底烧瓶中，并添加15mlmeoh。在室温下将反应物搅拌4h，添加20ml 10％柠檬酸(w/w)，然后用20％nahco3和水洗涤。用无水mgso4干燥有机层，过滤并浓缩，获得73％产率的白色固体。核磁共振氢谱检测结果如下：
[0071]1h-nmr(400mhz,cdcl3):δppm:7.40(d,j＝4.0hz,1h),7.21(dd,j＝4.0hz,j＝8.0hz,1h),7.16(dd,j＝4.0hz,j＝8.0hz,1h),4.61(s,2h),3.14(s,3h),3.01(s,3h).
[0072]
(5)荧光探针cep1的制备
[0073]
将中间体2(185mg,0.55mmol)、diea(0.8ml)和三光气(330mg,1.1mmol)在干燥二氯甲烷中的混合物，ar保护下在冰浴中搅拌2h。随后将混合物溶液在n2保护下于90℃回流12h，然后加入中间体4(130mg,0.56mmol)搅拌12h，然后将反应溶液冷却至室温蒸发。通过柱色谱(硅胶，梯度ch2cl2/meoh)纯化所得残余物，获得35％产率的深蓝色固体(式ii所示化合物)。核磁共振氢谱检测结果如下：
[0074]1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δppm:8.69(d,j＝8.0hz,1h),8.27(d,j＝8.0hz,1h),7.76(t,j＝4.0hz,1h),7.67(m,2h),7.62(d,j＝4.0hz,1h),7.43(dd,j＝8.0hz,j＝4.0hz,j＝4.0hz,1h),7.30(d,j＝8.0hz,1h)6.97(s,1h),6.94(d,j＝8.0hz,1h),6.89(d,j＝4.0hz,1h),5.23(s,2h)3.47(q,j＝8.0hz,4h),3.05(s,3h),2.84(s,3h),1.13(t,j＝
8.0hz,6h).
13
c-nmr(600mhz,dmso-d6):δppm:163.33,156.15,153.37,149.42,147.46,137.30,135.98,135.77,135.28,134.17,131.34,131.39,130.09,129.61,128.59,127.91,126.93,126.61,126.39,125.09,124.69,124.61,113.55,105.52,66.44,44.72(2c),36.90,36.65,11.89(2c).esi-hrms calc.for c
31h30
cln4o4s
+
,[m+h]
+
,589.17,found:589.16.
[0075]
实施例2
[0076]
光谱性质测定
[0077]
以荧光探针cep1为研究对象，考察其在pbs溶液中，于37℃，与ces反应3h，反应前后的紫外可见光谱与荧光光谱的变化。结果如图3所示，cep1与羧酸酯酶反应后，紫外可见光谱红移，与荧光团enbs一致。荧光光谱反应前无明显荧光发射峰，与羧酸酯酶反应后于700nm处出现明显荧光发射峰，与enbs一致。说明反应该探针与ces反应后，释放出荧光团enbs，荧光发生“关-开”，可用于ces的检测。
[0078]
实施例3
[0079]
荧光探针cep1的细胞毒性
[0080]
以荧光探针cep1为研究对象，采用mtt实验方法，考察荧光探针在正常肝细胞hl-7702及肝癌细胞hepg-2(市售来源)中的细胞毒性。实验结果如图4所示，无光照时，在较大浓度下，细胞仍有较高存活率，说明该荧光探针有较小的细胞毒性，可用于活细胞成像。在光照条件下(600nm)，该荧光探针对肿瘤细胞的光毒性强于正常细胞，说明可用于光动力治疗肿瘤。
[0081]
实施例4
[0082]
荧光探针cep1在细胞成像中的应用
[0083]
以荧光探针cep1为研究对象，考察其在ces高表达的hepg-2细胞中的成像应用，选择ces低表达的细胞hl-7702进行对照。
[0084]
具体步骤为：hl-7702细胞和hepg-2细胞用含有10％胎牛血清的dmem培养基在5％co2及37℃的环境中进行培养。成像前，将细胞接种于共聚焦小皿中，培养24h，弃去培养基，加入荧光探针cep1(10μm，用不含血清培养基配制)，相同条件下，加入ces抑制剂bnpp(100μm)孵育30min后加入荧光探针cep1继续孵育1h作为阴性对照。孵育完毕后，弃去培养基，pbs洗涤，用共聚焦荧光显微镜进行成像。
[0085]
成像结果如图5所示，荧光探针cep1能够测定ces且在高表达ces的hepg-2细胞中荧光强度更强，在与ces抑制剂bnpp孵育后，荧光强度减弱，说明探针ep1可用于ces的检测，在ces相关的生理病理及相关疾病的研究有广阔的应用前景。
[0086]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。