一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体的制作方法

一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体
1.本技术是以下申请的分案申请：申请日：2020年8月28日；申请号：202010886832.3；发明名称“一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体”。
技术领域
2.本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体。


背景技术：

3.肌酸脒基水解酶是酶促方法检测肌酐含量的必不可少的酶，它能够将肌酸转化成肌氨酸和尿素，进一步生成能够进行化学检测的过氧化氢。该酶主要来源于微生物，目前已被广泛应用于医疗诊断、有机合成等行业。
4.肌酸脒基水解酶用于工业上测定肌酐含量，除此之外，也经常被用于临床分析诊断血清和尿液中肌酐含量和与健康机体中肌酐含量不同的肾脏疾病。肌酐是应用人体磷酸肌酸代谢的最终产物，经肾脏过滤后，再从血液中进入尿液，排出体外。一般来说，血清肌酐的正常范围在35～150μm之间，但当肾功能或肌肉功能出现问题时，肌酐含量会上升至1000μm，血液和尿液中的肌酐含量可以反映肾脏的排泄功能。目前为止检测肌酐含量最常用的是jaffe化学检测方法和酶比色法。相比之下，由于酶促检测法较高的灵敏度和选择性等特点，日益受到关注。在酶促检测方法中，待测样品通过肌肝水解酶，肌酸脒基水解酶和肌氨酸氧化酶连续转化，最终肌酐被降解为过氧化氢，通过在辣根过氧化物酶催化下的比色反应来确定过氧化氢的浓度，从而达到检测肌酐含量的目的。
5.因此，为了更好的将肌酸脒基水解酶应用于临床肌酐检测，本发明利用共识设计方法获得了热稳定性提高的的肌酸脒基水解酶突变体、本发明采用基于传统的共识方法改进的无系统发育偏见的共识方法筛选得到21个氨基酸突变位点并对其进行定点突变，获得了热稳定显著提升的突变酶，解决了现有的肌酸脒基水解酶热稳定性差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为拓宽肌酸脒基水解酶的工业应用奠定了基础。


技术实现要素：

6.为了更好的将肌酸脒基水解酶应用于临床肌酐检测，本发明利用共识设计方法获得了热稳定性提高的的肌酸脒基水解酶突变体、本发明采用基于传统的共识方法改进的无系统发育偏见的共识方法筛选得到21个氨基酸突变位点并对其进行定点突变，获得了热稳定显著提升的突变酶，解决了现有的肌酸脒基水解酶热稳定性差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为拓宽肌酸脒基水解酶的工业应用奠定了基础。
7.本发明第一个目的是提供一种肌酸脒基水解酶的突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体氨基酸序列为如下(a1)或(a2)所示：
8.(a1)将seq id no.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与seq id no.1的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；
9.(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代seq id no.1示的氨基酸序列的一个或多个位置且与seq id no.1示的蛋白表现出至少92％同源性的衍生蛋白。
10.优选地，该肌酸脒基水解酶突变体，seq id no.1示的氨基酸序列的突变位点包括以下至少一个：第6位、第17位、第58位、第108位、第117位、第165位、第199位、第251位、第349位及第351位。
11.进一步优选地，该肌酸脒基水解酶突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体包括在seq id no.1示的氨基酸序列上l6p、d17v、g58d、f108y、t117p、q165i、t199s、t251c、e349v、k351e中任一单点突变位点的单点突变体。
12.进一步优选地，该肌酸脒基水解酶酶突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体包括在seq id no.1示的氨基酸序列上l6p/d17v、d17v/g58d、d17v/t251c、d17v/k351e、d17v/t199s、d17v/f108y、d17v/y109f、d17v/q165i、d17v/e349v、d17v/t199s/t251c、d17v/f108y/t199s、d17v/y109f/t199s、d17v/t199s/k351e、l6p/d17v/t199s、l6p/d17v/t199s/k351e、l6p/d17v/f108y/t199s、d17v/t199s/l6p/、l6p/d17v/y109f/t199s/t251c、l6p/d17v/f108y/t199s/k351e、l6p/d17v/y109f/t199s/k351e、l6p/d17v/t199s/k351e/t251c等组合突变体。
13.本发明的第二个目的是提供编码所述肌酸脒基水解酶突变体的基因。
14.在本发明的一种实施方式中，所述基因含有seq id no.2核苷酸序列。
15.本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。
16.本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞。
17.在本发明的一种实施方式中，所述细胞为真菌细胞或细菌细胞。
18.在本发明的一种实施方式中，所述细胞为大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。
19.本发明的第五个目的是提供32种提高肌酸脒基水解酶热稳定性的突变体，包括以下步骤：
20.1、在ncbi数据库中搜索seq id no.1的氨基酸序列，删除重复出现的相同序列，选取与seq id no.1氨基酸序列一致性大于50％的氨基酸序列；
21.2、然后通过clustalx2.1软件进行多序列比对，将剩余氨基酸质序列整理成fasta.文件导入到mega7.0软件，利用其phylogenetic模块中nj算法构建系统发育树；
22.3、根据系统发育树的分支距离引入权重，通过python脚本计算consensus sequence，结合同源建模结构筛选出热稳定性相关的突变位点为l6p,d17v,p20t,v33l,c52n,g58d,w59f,d73t,f108y,y109f,t117p,l162a,v340l,q165i,v362i,t199s,k166a，t251c,c331s,e349v,k351e。
23.在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将genbank登录号为baa88830.1的肌酸脒基水解酶的以下位点进行突变：
24.(1)seq id no.1所示氨基酸序列的第6位亮氨酸被脯氨酸取代，记为l6p；
25.(2)seq id no.1所示氨基酸序列的第17位天冬氨酸被缬氨酸取代，记为d17v；
26.(3)seq id no.1所示氨基酸序列的第58位甘氨酸被天冬氨酸取代，记为g58d；
27.(4)seq id no.1所示氨基酸序列的第108位苯丙氨酸被酪氨酸取代，记为f108y；
28.(5)seq id no.1所示氨基酸序列的第117位苏氨酸被脯氨酸取代，记为t117p。
29.(6)seq id no.1所示氨基酸序列的第165位谷氨酰胺被异亮氨酸取代，记为
q165i。
30.(7)seq id no.1所示氨基酸序列的第199位苏氨酸被丝氨酸取代，记为t199s。
31.(8)seq id no.1所示氨基酸序列的第251位苏氨酸被半胱氨酸取代，记为t251c。
32.(9)seq id no.1所示氨基酸序列的第349位谷氨酸被缬氨酸取代，记为e349v。
33.(10)seq id no.1所示氨基酸序列的第351位赖氨酸被谷氨酸取代，记为k351e。本发明技术方案，具有如下优点：
34.1.本发明提供的肌酸脒基水解酶突变体包括单点突变体和组合突变体，与野生型肌酸脒基水解酶(baa88830.1)相比，其单点突变体和组合突变体在55℃及57℃下半衰期均更长；尤其是组合突变体，表现出单点突变体热稳定性的叠加效果，其半衰期大约是野生型肌酸脒基水解酶(baa88830.1)的2841倍。基于此，本发明所提供的肌酸脒基水解酶突变体的热稳定性更好，通过本发明所提供的构建方法得到的肌酸脒基水解酶突变体在较高的温度下催化肌酸生成肌氨酸和尿素时表现出优良的热稳定和催化活性。
35.2.本发明构建的肌酸脒基水解酶(baa88830.1)基因工程菌可以高效表达肌酸脒基水解酶突变体,且培养条件简单，培养周期短，表达产物纯化方便等优点。
具体实施方式
36.突变体命名方式：
37.采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如l6p，表示位置6的氨基酸由亲本肌酸脒基水解酶的leu替换成pro，位置的编号对应于亲本肌酸脒基水解酶的氨基酸序列。
38.实施例1：单点肌酸脒基水解酶(baa88830.1)突变体的构建
39.野生型肌酸脒基水解酶质粒pany1-cr-af-wt由实验室保藏，通过全质粒pcr方法构建单点肌酸脒基水解酶突变体。细节如下：以pany1-cr-af-wt为模板，各突变位点的上下游引物列于表1中，分别以“突变位点取代氨基酸”的格式命名。使用高保真dna聚合酶primestar hs dna polymerase试剂盒，进行一轮进行pcr扩增以期获得含有突变体的基因重组质粒。反应体系如表2所示，pcr条件：预变性：95℃4min；变性：98℃10s；退火：55℃5s；延伸：72℃6min；循环25次；充分延伸：72℃10min。
40.表1引物表
[0041][0042][0043]
使用高保真dna聚合酶primestar hs dna polymerase试剂盒，进行一轮进行pcr扩增以期获得含有突变体的基因重组质粒。反应体系如表2所示，pcr条件：预变性：95℃4min；变性：98℃10s；退火：55℃5s；延伸：72℃6min；循环25次；充分延伸：72℃10min。
[0044]
表2第一轮pcr扩增的反应体系
[0045][0046]
实施例2：多点肌酸脒基水解酶(baa88830.1)突变体的构建
[0047]
为了进一步分析每个位点上不同氨基酸种类对酶催化特性的影响，参考定点突变
的方法，仍然采用全质粒pcr技术以获得饱和突变文库基因，细节如下：使用高保真dna聚合酶primestar hs dna polymerase试剂盒，进行多轮进行pcr扩增以期获得含有突变体的基因重组质粒。反应体系、pcr条件和转化条件与定点突变条件相同。
[0048]
实施例3：突变工程菌构建
[0049]
参照超级感受态试剂盒说明书，稍作修改，构建工程菌，具体操作如下。首先，确认e.coli bl21(de3)不能在kan抗性下生长；第二步，将所述e.coli bl21(de3)划线分离活化；第三，取单菌落加入不含抗性的lb培养基中培养至od
600
在0.5到0.6之间，用试剂盒自带溶液制备感受态细胞；第四步，转化并涂于含kan抗性的lb固体培养基平板上，培养14h；最后，挑取5个单菌落，采用菌液pcr扩增其目的基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定有目的条带后，选送苏州金唯智测序，确认工程菌。
[0050]
实施例4：肌酸脒基水解酶突变体(baa88830.1)蛋白的表达和纯化
[0051]
将甘油管中的工程菌按体积比1％接种到含100μg/ml卡那霉素(kan
+
)的4ml 2yt液体培养基试管中，在37℃、220rpm下培养11h；然后将该4ml菌液转接至含50μg/ml卡那霉素(kan
+
)的2yt液体培养基的1l摇瓶中，在37℃、220rpm下培养约3h，使od600达到0.8左右；再加入0.1mm iptg诱导剂，在25℃、200rpm下诱导培养11-17h，本实施例中诱导培养14h。将诱导表达后收获的大肠杆菌菌体悬液离心，再经过一步ni-nta亲和层析处理，得到纯度＞95％的肌酸脒基水解酶蛋白。
[0052]
实施例5：肌酸脒基水解酶突变体的性质表征
[0053]
将优化的野生型肌酸脒基水解酶(baa88830.1)以及实施例3提供的多种肌酸脒基水解酶突变体进行热稳定性测试，肌酸脒基水解酶活力测定方法具体为：
[0054]
肌酸脒基水解酶的测活反应基于酶偶联催化体系，其在反应体系中催化肌酸生成肌氨酸和尿素，肌氨酸可以在肌氨酸氧化酶(sox)的催化下反应，同时可以生成过氧化氢(h2o2)，过氧化氢可以在辣根过氧化酶的催化下与toos(n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)间甲苯胺钠盐)和4-ap(4-aminoantipyrine，4-氨基安替比林)反应，生成紫色的化合物。因此，我们通过uv-2550紫外可见光分光光度计(岛津)监测单个酶促反应体系在555nm波长处紫外吸收变化量，来评估肌酸脒基水解酶的活性变化，在此单位活性被定义为每分钟产生1μm过氧化氢的酶量。
[0055]
酶反应体系为：0.5mm toos(n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)间甲苯胺钠盐)，0.45mm 4-ap(4-aminoantipyrine，4-氨基安替比林)，900u/l辣根过氧化物酶，0.1m磷酸钾缓冲液(ph 7.5)。
[0056]
1)在肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶的催化作用下，通过酶多级偶联方法测量肌酸脒基水解酶的活性,利用磷酸盐缓冲液(0.1m，ph 7.5)将待测样品酶浓度稀释至1mg/ml。底物溶液由500μm肌酸，0.45mm 4-aa(4-氨基安替比林)，0.5mm toos(n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)和磷酸盐缓冲液(0.1m，ph 7.5)配制而成，并在37℃下进行孵育。取950μl底物溶液并向其中添加50μl待测样品酶来测定酶的活性，通过uv2550分光光度计(shimadzu)监测酶反应体系中555nm处的紫外线吸收的变化，单位活性定义为每分钟产生1μm过氧化氢的酶量。
[0057]
2)将纯化的酶的浓度在磷酸盐缓冲液(0.1m，ph 7.5)中稀释至1.0mg/ml，并分别置于55℃及57℃孵育不同时间0min，5min，10min,15min，20min，30min进行酶失活预实验，
估计野生型肌酸脒基水解酶(baa88830.1)的半衰期t
1/2
。半衰期计算公式：t
1/2
＝-ln(2)/k，k为酶的剩余相对活力的自然对数值与热处理时间作图的直线斜率。实验结果表明，上述单点突变体和组合突变体的热稳定性得到明显改善，如表3所示：
[0058]
由表3得知，本发明提供的肌酸脒基水解酶突变体包括单点突变体和组合突变体，通过测定野生型肌酸脒基水解酶(baa88830.1)、肌酸脒基水解酶突变体在57℃时的半衰期发现，与优化的野生型肌酸脒基水解酶(baa88830.1)相比，其中的八种肌酸脒基水解酶突变体在57℃的热稳定性得到了明显的提高，这八种肌酸脒基水解酶突变体分别为：t117p/t199s/t251c、f108y/t117p/t199s、t199s/d17v/k351e、l6p/t117p/t199s、l6p/t117p/f108y/t199s、l6p/d17v/t199s/t251c、l6p/t117p/f108y/t199s/t251c和l6p/t117p/t199s/t251c/k351e，具体结果如表3所示。
[0059]
表3.野生型肌酸脒基水解酶及其突变体的酶学性质表征
[0060]
[0061][0062]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。