一种肺癌长链非编码RNA生物标志物及其应用

本发明涉及遗传工程，具体涉及一种肺癌lncrna生物标志物及其应用。

背景技术：

1、肺癌是一种高发病率高死亡率的恶性肿瘤，云南是我国的癌症高发地区。目前肺癌的诊断大多依靠病理学活检和影像学检查，而这两种检测方法都存在着各自的缺陷，并不适用于肺癌的早期诊断。临床常用的肿瘤标志物都有敏感性和特异性不佳的问题，因此迫切需要找寻一种具有较好的敏感性和特异性的肺癌标志物。多项研究表明lncrna有作为多种癌症标志物的潜力，本发明在前期研究的基础上，从lncrna芯片结果中挑选出一部分表达差异较大的lncrna，对目标lncrna进行筛选验证，建立相对定量的实时荧光定量pcr检测方法。检测目标lncrna在肺癌患者血清中的表达并评估其作为肺癌诊断标志物的价值。

2、2020年全球共新增癌症病例达1930万例，其中肺癌占比11.4％，约220万例，且肺癌仍然是癌症死亡的主要原因，约有180万死亡病例。根据国家癌症中心登记的数据，肺癌仍然是中国发病率和死亡率最高的癌症，也是中国男性最常见的癌症。而且癌症在我国各个地区都属于高发恶性肿瘤，对人民生命健康威胁巨大。

3、肺癌是一种起源于肺部支气管黏膜或腺体的常见恶性肿瘤，按照组织学分型可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌又可分为腺癌、鳞癌和大细胞癌几种亚型，不同的亚型往往有着不同的病理特征和生长扩散特点。肺癌的病因至今仍未完全阐明，有观点认为是原癌基因或抑癌基因突变导致了肺癌的发生。目前临床上大多根据病理学活检、影像学检查、临床症状和肿瘤标志物检测对肺癌做出诊断，病理学活检虽然是金标准，但是对于人体损伤过大且并非所有适用于所有患者，影像学检查虽然提高了肺癌的检出率，但是仍然有放射损伤和定位困难等缺点。肿瘤标志物能够反映肿瘤的存在和生长，且表达水平改变往往早于临床影像学表现，检测过程具有无创、快速、可动态监测等优势，适合应用于大规模人群筛查及肺癌诊治全程。肺癌标志物如癌胚抗原(cea)、癌抗原125(ca125)、鳞状细胞癌相关抗原(scc)、细胞角质蛋白21-1片段(cyfra21-1)等已经广泛运用于肺癌临床的诊断治疗预后中，但这些标志物也存在着特异性、灵敏度较差等缺点，随着肺癌的发病趋于年轻化，也为了满足肺癌的早诊断早治疗早康复的需求，寻找新的能更好地指导临床的肺癌标志物就显得刻不容缓。

4、人类基因组研究计划指出人类基因组中仅有1％-2％的蛋白质编码rna，其余的98％被认为是无用dna。大多数无用dna实际上被转录成如snrna、snorna、microrna和circularrna等非编码rna，这些rna大多没有或仅有很少的编码潜能，但是同样在人体细胞的正常生理活动中扮演着重要的角色。近年来，越来越多的非编码rna(ncrnas)已被确定为许多生物过程的关键调控因子，包括基因表达调控、细胞周期控制、凋亡、细胞身份决定、染色质重塑和表观遗传修饰，想要弄清不同类型的细胞在特定的时间内ncrnas的功能以及它们之间、它们和dna之间的相互作用还有很长的路要走，远比基因组计划更为艰巨。因此，摸清ncrna的调控网络会为破解生命的奥秘提供巨大的帮助和启发。

5、长链非编码rna(longncrna，简称lncrna)是一组长度超过200个核苷酸的异质性ncrna。lncrna一般由rna聚合酶ⅱ转录而来，结构与信使rna相似，具有多聚(a)尾巴、5’-帽结构和启动子结构，但是缺少开放阅读框，因此也就不具备编码蛋白质的能力。lncrna功能包括:(1)招募染色质重构和修饰复合体到特定位点，改变dna/rna甲基化状态、染色体结构和修饰状态，进而控制相关基因的表达；(2)与mrna结合，调控mrna的翻译；(3)与某些转录因子结合成复合体，影响mrna转录；(4)作为竞争性内源rna(competing endogenous rna，cerna)，竞争结合mirna的目标mrna。近年来已经有多项研究表明lncrna与多种肿瘤的发生发展有着密切的关系，使得lncrna越发受到业内关注。在liu等人的研究中，宫颈癌细胞中高表达的lncrna snhg1能够有效的促进宫颈癌的发展，而敲低snhg1的表达就能够有效抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。lncrna nbr2与肝细胞癌、大肠癌、甲状腺癌等多种癌症的发生发展有着密切的关系，是目前一个重要研究的lncrna，此外nbr2也能够通过调节nsclc中的相关通路抑制emt进展。这就说明了lncrna在人体内存在和作用的广泛性和复杂性，也为lncrna的研究提供了新的思路。

6、液体活检即通过微创的手段获取脑脊液、血液、尿液和唾液等样本对疾病进行诊断，lncrna在外周血、外泌体及tep(tumor educated platelet)中含量较高易于富集和检测，在肺癌诊断中具有较大潜力。随着对lncrna分子机制和生物学功能的进一步了解，lncrna在肿瘤早期诊断和预后标志物中的作用越来越受到重视。以往的方法都是采用侵入性的方法从人体组织中提取lncrna，目前的研究表明从体液中获得稳定的循环lncrna是可能的。lncrna广泛存在于血液、唾液、胃液和尿液等各种体液中。lncrna在体液中也高度稳定，即使在反复冻融、45℃孵育24h、室温孵育24h以及其他恶劣条件下，它们也表现出显著的稳定性，这表明人体内存在一种保护循环中的lncrna免受外界降解的机制。目前，循环中的lncrna被认为主要由肿瘤细胞分泌，主要包含在脂质或脂蛋白小泡中(如凋亡小泡、外泌体或微泡)，从而抵抗核糖核酸酶在体液中的降解。lncrna的高稳定性和在各种体液中的广泛存在，使得循环中的lncrna成为肿瘤潜在的生物标志物。目前，循环lncrna已成为肿瘤非侵袭性诊断和预后的新热点，近年来的研究表明，多种lncrna可作为肿瘤生物标志物，对临床研究具有重要意义。而对于标本收集，有研究表明使用了edta抗凝剂和无抗凝剂分离得到的血清或血浆相比使用肝素抗凝剂分离得到的血清中的lncrna含量更高且稳定性更好，这一点也指导了本发明的收集标本的选择。

7、血液中循环的lncrna是如何产生的，其在血液中长期循环的机制尚不清楚。最普遍的解释是，它作为一种循环核酸(cna)，可能源于肿瘤细胞的自我分泌、裂解凋亡和坏死。许多研究表明，在接受手术的癌症患者血清中，lncrna的表达水平改变可以反映手术效果和肿瘤动态，有希望成为多种癌症的诊断标志物。在han等人的研究中，与配对的术前血浆相比，术后gas5和h19水平分别在71.8％和82.1％的乳腺癌患者血浆中表达显着降低，且术前ki67增殖指数高的患者(p＝0.012)和术后淋巴结转移阳性的患者(p＝0.029)血浆gas5水平较低，因此认为血浆lncrna gas5具有评估乳腺癌患者手术效果和预后的潜力而h19可以成为检测乳腺癌的潜在标志物。在另一项研究中，zheng等人经过两个阶段的验证表明，与健康对照组相比，胃癌患者血浆中fam49b-as，gusbp11和ctdhut三种lncrna的血浆水平更高(p<0.05)，并且三种lncrna联合诊断的auc为0.818(95％ci:0.772-0.864)，在根治性手术后第10天，三种lncrna的血清表达水平相比术前均显著下降(p<0.05)，因此认为这三种lncrna的表达水平变化能够对手术的治疗效果进行评估。lncrna h19在nsclc患者血浆相对表达水平比良性肺疾病患者高，且h19对nsclc的诊断敏感度为67.74％，特异性为63.08％，roc曲线下的面积为0.73，cut-off值为6.62，可作为血清学指标辅助诊断nsclc。lncrna有望成为包括癌症在内的多种疾病的新型诊断标志物，因此对于循环lncrna的研究就显得尤为重要。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题，本发明的第一目的在于提供一种肺癌lncrna生物标志物及其应用。

2、为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种肺癌长链非编码rna生物标志物，所述的肺癌长链非编码rna生物标志物为fam30a(family with sequencesimilarity 30 member a)，awpph(mir4435-2 host gene)，chchd4p4(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 4 pseudogene 4)，sra1(steroidreceptor rna activator 1)和snhg15(small nucleolar rna host gene 15)。

3、进一步地，所述的fam30a，awpph，chchd4p4，sra1和snhg15的正向引物的核苷酸序列分别为如seq id no.1、3、5、7、9所示，所述的fam30a，awpph，chchd4p4，sra1和snhg15的反向引物的核苷酸序列分别为如seq id no.2、4、6、8、10所示。

4、进一步地，所述的肺癌长链非编码rna awpph在肺癌组织和肺癌患者血清中表达均上调，本发明结果与芯片结果一致。

5、本发明所述的肺癌上调长链非编码rna标志物在制备肺癌早期诊断产品中的应用，所述的诊断产品包含检测所述的一种或多种标志物的试剂，所述的试剂通过检测受试者标本中所述的一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否患有肺癌。

6、进一步地，所述的标本是肺组织或血液。

7、进一步地，所述的试剂是基于基因芯片检测或实时荧光定量pcr检测所述的一种或多种标志物浓度时所需的试剂。

8、更进一步地，所述的诊断产品是试剂盒、芯片或检测平台。

9、本发明含有所述的肺癌长链非编码rna生物标志物的肺癌早期诊断试剂盒。

10、进一步地，该试剂盒用于检测肺组织或血液中fam30a和/或awpph和/或chchd4p4和/或sra1和/或snhg15。

11、本发明所述的肺癌上调长链非编码rna标志物awpph联合血清肿瘤标志物cyfra21-1在制备肺癌早期诊断产品中的应用。联合检测时能在保持较高的特异性的基础上提高检测的敏感性，说明awpph与cyfra21-1可能是一对针对肺癌较好的诊断组合。

12、有益效果：本发明表明肺癌长链非编码rna生物标志物是潜在的肺癌诊断标志物，awpph联合血清肿瘤标志物cyfra21-1可以进一步提高肺癌的诊断效能。联合检测时能在保持较高的特异性的基础上提高检测的敏感性，说明awpph与cyfra21-1可能是一对针对肺癌较好的诊断组合。

13、与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)结合前期研究取得的芯片结果，选择了5条在肺癌组织和癌旁组织中表达差异倍数较大的lncrna：fam30a，awpph，chchd4p4，sra1和snhg15。选取了lncrna awpph进行下一步的血清大样本检测，就是采用qrt-rcr的方法检测肺癌组、肺良性疾病组、健康组血清中awpph的表达水平。使用ddpcr对扩增曲线进行校正，以β-actin为内参基因，用2-δδct计算血清awpph相对表达水平。通过roc曲线评价外awpph对肺癌的诊断效能。