具有聚集诱导发光的近红外荧光纳米探针及其制备方法

1.本发明属于荧光探针领域，具体为一种具有聚集诱导发光性能的近红外荧光纳米探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.荧光成像已发展成为生物医学研究的有力工具，并为实时跟踪和监测特定生物过程开辟了新途径。有机荧光染料具有可设计的化学结构、良好的生物相容性、优异的光学性能，而发展成为生物成像应用的构筑基元。传统荧光探针的发射波长通常小于650nm，该区域的荧光容易受到细胞自身荧光和光散射的干扰，且用短波长激发易对生物组织造成光损伤，这些缺陷严重限制了其在生物成像中的应用。发射波长大于650nm的近红外荧光探针，具有自荧光干扰低、光损伤小等优点可用在深部组织成像中，所以近红外荧光探针的研究备受关注。
3.苝二酰亚胺具有良好热稳定性和光化学稳定性，可被广泛用作生物传感器、荧光发射器和染料激光器。然而在强大的分子间π-π堆积相互作用的驱动下，苝二酰亚胺发色团易聚集而导致荧光猝灭，这就严重限制了苝二酰亚胺在荧光传感器和生物成像中的应用。而聚集诱导荧光增强分子的发展成功克服了发光猝灭的现象，如具有螺旋桨结构的四苯基乙烯是典型的aie发色团，其扭曲的构象可以有效地防止分子间的π-π堆积从而避免荧光猝灭。将aie发色团引入到荧光分子中是构筑具有独特aie特性荧光分子的有效策略。随着对生理病理学以及细胞学的深入研究，具有靶向功能的荧光探针为研究病理状态与细胞器之间的关系提供了有力途径，可以明显提高肿瘤细胞的诊断效率。因此，制备具有聚集诱导荧光增强和靶向特性的新型近红外荧光探针对于生物成像的研究具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种具有聚集诱导发光性能的近红外荧光纳米探针及其制备方法，该荧光纳米探针不仅在近红外区域具有聚集诱导荧光增强的特性，而且具有良好的生物相容性和光学稳定性，可用于肿瘤细胞的靶向生物成像；该方法简单易行，产物易分离纯化，反应设备简单，操作条件温和，易于实现工业化生产。
5.为实现上述目的，本发明首先提供一种有机荧光染料，所述有机荧光染料的基本结构由四苯基乙烯、胆固醇及苝二酰亚胺构成，其通式为c
132h136
n4o
10
tn，式中：tn为烷基碳链-2(ch2)
n-，其中n＝2～10，结构式为：
[0006][0007]
本发明提供一种有机荧光染料的制备方法，即采用胆固醇氯甲酸酯与烷基二胺反应，得到中间产物1；然后利用上述中间产物1与1,7-二溴-3,4,9,10-苝四羧基双酐反应，得到中间产物2；再利用中间产物2与1-(4-羟基苯)-1,2,2-三苯乙烯得到四苯基乙烯、胆固醇修饰的苝二酰亚胺化合物tm。
[0008]
反应过程为：
[0009][0010]
具体制备方法，包括如下步骤：
[0011]
(1)中间产物1的合成
[0012]
将烷基二胺加入二氯甲烷中，保持其浓度为12－35mg/ml；加入三乙胺，保持烷基
二胺与三乙胺的摩尔比为10－25:1；加入胆固醇氯甲酸酯，使烷基二胺与胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为15－30:1；在0℃氮气气氛下反应1－3小时后室温下继续反应16－24小时。过滤收集滤液旋转蒸发除去溶剂，水洗3次，用二氯甲烷/甲醇重结晶3次，得到中间产物1；
[0013]
烷基二胺为1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺、1,6-己二胺、1,7-庚二胺、1,8-辛二胺、1,9-壬二胺或1,10-癸二胺。
[0014]
(2)中间产物2的合成
[0015]
将1,7-二溴-3,4,9,10-苝四羧基双酐溶于体积比为1－4:1的水/异丙醇混合溶液中，保持其浓度为4－8mg/ml；加入中间产物1，使中间产物1与1,7-二溴-3,4,9,10-苝四羧基双酐的摩尔比为3－6:1；回流反应24小时后离心分离收集沉淀，溶于氯仿后过滤除去不溶物；再将乙醚加入滤液中，所得不溶物再用氯仿/乙醚重结晶3次，得到中间产物2；
[0016]
(3)tm的合成
[0017]
将中间产物2溶于n-甲基吡咯烷酮中，保持其浓度为1－10mg/ml；加入1-(4-羟基苯)-1,2,2-三苯乙烯，使1-(4-羟基苯)-1,2,2-三苯乙烯与中间产物2的摩尔比为3－6:1；加入碳酸钾，使碳酸钾与1-(4-羟基苯)-1,2,2-三苯乙烯的摩尔比为6:1；n2气氛85℃下反应24小时后，将上述反应液加至稀盐酸中，分离除去所产生的沉淀；收集滤液用二氯甲烷作为洗脱剂进行柱分离，得到目标化合物tm。
[0018]
本发明提供一种具有聚集诱导发光性能的近红外荧光纳米探针，其是用含crgd环肽的聚合物基质包覆如上所述的有机荧光染料制备而成，具体包括以下步骤：
[0019]
将有机荧光染料(tm)溶于四氢呋喃中，保持其浓度为1－6mg/ml；将dspe-peg
2000-crgd和dspe-peg
2000
溶于水体积百分比为90％的水/四氢呋喃混合溶液中，使二者的摩尔比为0.8－1.3:1；将tm的四氢呋喃溶液倒入聚合物基质溶液中超声1－2分钟；将上述微乳液于室温下搅拌至少24小时以除尽四氢呋喃；用0.22mm过滤器过滤上述溶液得到纳米荧光探针np。
[0020]
与现有技术相比本发明的有益效果：
[0021]
(1)本发明提供了一种具有聚集诱导发光性能的近红外荧光纳米探针，该纳米荧光探针在近红外区域具有聚集诱导荧光增强的特性；
[0022]
(2)带crgd环肽的两亲性聚合物基质包覆后的纳米荧光探针具有良好的生物相容性和光学稳定性，且最终制备的纳米粒子对肿瘤细胞具有明显的特异性靶向生物成像；
[0023]
(3)纳米荧光探针的制备方法简单易行，产物易分离纯化，反应设备简单，操作条件温和，易于实现工业化生产。
附图说明
[0024]
图1：实施例1中中间产物1的核磁共振氢谱；
[0025]
图2：实施例1中中间产物2的质谱；
[0026]
图3：实施例1中所述有机荧光染料分子tm-2的质谱；
[0027]
图4：实施例1中所述有机荧光染料分子tm-2的热重分析曲线；
[0028]
图5：实施例4中所述有机荧光染料分子tm-2在四氢呋喃-水体系下的荧光发射光谱；
[0029]
图6：实施例5中所述荧光纳米探针的紫外吸收光谱和荧光发射光谱；
[0030]
图7：实施例6中所述荧光纳米探针在水体系下的粒度分布图和透射电镜图片；
[0031]
图8：实施例7中所述荧光纳米探针的光稳定性测试；
[0032]
图9：实施例8中所述荧光纳米探针与细胞培养后的激光共聚焦显微镜图片；
具体实施方式
[0033]
实施例1：tm-2的结构与合成
[0034][0035]
(1)将1,2-乙二胺加入二氯甲烷中，保持其浓度为24mg/ml；加入三乙胺，保持1,2-乙二胺与三乙胺的摩尔比为10:1；加入胆固醇氯甲酸酯，使1,2-乙二胺与胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为20:1；在0℃氮气气氛下反应2小时后室温下继续反应16小时。过滤收集滤液旋转蒸发除去溶剂，水洗3次，用二氯甲烷/甲醇重结晶3次，得到中间产物1；
[0036]
(2)将1,7-二溴-3,4,9,10-苝四羧基双酐溶于体积比为1:1的水/异丙醇混合溶液中，保持其浓度为5mg/ml；加入中间产物1，使中间产物1与1,7-二溴-3,4,9,10-苝四羧基双酐的摩尔比为3:1；回流反应24小时后离心分离收集沉淀，溶于氯仿后过滤除去不溶物；再将乙醚加入滤液中，所得不溶物再用氯仿/乙醚重结晶3次，得到中间产物2；
[0037]
(3)将中间产物2溶于n-甲基吡咯烷酮中，保持其浓度为1.4mg/ml；加入1-(4-羟基苯)-1,2,2-三苯乙烯，使1-(4-羟基苯)-1,2,2-三苯乙烯与中间产物2的摩尔比为3:1；加入碳酸钾，使碳酸钾与1-(4-羟基苯)-1,2,2-三苯乙烯的摩尔比为1:1；n2气氛85℃下反应24小时后，将上述反应液加至稀盐酸中，分离除去所产生的沉淀；收集滤液用二氯甲烷作为洗脱剂进行柱分离，得到目标化合物tm-2。
[0038]
实施例2：纳米荧光探针np1的制备
[0039]
将tm-2溶于四氢呋喃中，保持其浓度为1.6mg/ml；将dspe-peg
2000-crgd和dspe-peg
2000
溶于水体积百分比为90％的水/四氢呋喃混合溶液中，使二者的摩尔比为1:1；将tm-2的四氢呋喃溶液倒入聚合物基质溶液中超声1分钟；将上述微乳液于室温下搅拌24小时以除尽四氢呋喃；用0.22mm过滤器过滤上述溶液得到纳米荧光探针np1。
[0040]
实施例3：纳米荧光探针np0的制备
[0041]
将tm-2溶于四氢呋喃中，保持其浓度为1.6mg/ml；将dspe-peg
2000
溶于水体积百分比为90％的水/四氢呋喃混合溶液中；将tm-2的四氢呋喃溶液倒入聚合物基质溶液中超声1分钟；将上述微乳液于室温下搅拌24小时以除尽四氢呋喃；用0.22mm过滤器过滤上述溶液得到纳米荧光探针np0。
[0042]
实施例4：tm-2的聚集诱导荧光增强特性
[0043]
tm-2具有典型的聚集诱导荧光增强特性，如图5所示，随着四氢呋喃-水体系中水体积百分比的增加，荧光发生了明显的变化。tm-2在纯四氢呋喃溶液中的发光很弱，当fw≥40％时，荧光强度逐渐升高，当fw为90％时tm-2的荧光最强。更重要的是，tm-2的荧光光谱覆盖了600～780nm范围内的近红外区域。
[0044]
实施例5：纳米荧光探针np1的光学性质
[0045]
图6展示了纳米粒子的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，由图可见，包裹后的纳米粒子np1的最大吸收峰和发射峰分别为520nm和670nm。np1具有150nm的大斯托克斯位移，以极大地减少自吸收，这非常有利于生物成像。
[0046]
实施例6：纳米荧光探针np1的结构分析
[0047]
图7是所得纳米荧光探针np1在纯水体系下的粒度分布图和透射电镜图。透射电子显微镜图片表明，纳米粒子自组装成了球形聚集体。动态光散射结果表明纳米荧光探针np1的平均直径为160nm，这个粒径尺寸对纳米粒子的细胞成像是有利的。
[0048]
实施例7：纳米荧光探针np1的光稳定性
[0049]
纳米荧光探针np1具有良好的光稳定性，如图8所示，通过用520nm的光连续照射35分钟后，纳米荧光探针np1没有显示出突然猝灭，仅有14％的荧光强度损失，良好的光稳定性有利于其生物成像的应用。
[0050]
实施例8：纳米荧光探针的靶向生物成像
[0051]
因为整合素αvβ3在特定肿瘤细胞的表面是高度表达的，而arg-gly-asp序列的环肽crgd与整合素αvβ3的具有特殊结合能力，所以含crgd环肽的纳米荧光探针np1可用于靶向肿瘤细胞成像。我们选用以下三种不同的细胞分别与纳米荧光探针进行孵育：人宫颈癌细胞(hela细胞)、人结直肠腺癌细胞(hct-116细胞)人正常肝细胞(hl-7702细胞)。如图9所示，与含crgd环肽的纳米荧光探针np1孵育后，hela细胞和hct-116细胞的胞浆中显示出明显的红色荧光，表明np1可以进行有效的胞内摄取。相比之下，与np1孵育后的人正常肝细胞(hl-7702)没有观察到荧光，表明纳米荧光探针np1对肿瘤细胞具有特异性靶向能力。与不含crgd环肽的np0孵育后的hela细胞的荧光强度远弱于与np1孵育之后的荧光强度，与np0孵育的hct-116细胞和hl-7702细胞中未观察到荧光，这是纳米粒子表面不含环肽crgd所导致的。