7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在合成熊去氧胆酸中的应用

本发明属于生物工程，尤其是涉及一种高稳定性的来源于玫瑰球菌属(roseococcus sp.)的7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hsdh)突变体，其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组7β-羟基类固醇脱氢酶催化剂， 7β-羟基类固醇脱氢酶或重组7β-羟基类固醇脱氢酶催化剂在合成熊去氧胆酸中的应用，以及应用连续流填充床反应器系统催化7-羰基石胆酸还原制备熊去氧胆酸的方法。

背景技术：

1、熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,udca)是鹅去氧胆酸(chenodeoxycholicacid,cdca)的差向异构体，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，化学式 c24h40o4，是一种白色粉末状的固体，不溶于水，易溶于碱性溶液。其化学结构式如下所示：

2、

3、熊去氧胆酸化学结构式

4、熊去氧胆酸是一种在临床上常用于治疗肝内胆汁淤积症和胆固醇结石的活性药理成分(api)。目前，熊去氧胆酸主要从活熊胆中提取，或者以胆酸或鹅去氧胆酸为原料通过化学法来合成。活熊取胆法产率低，周期长，并且对黑熊的生理和心理造成双重折磨，有违人道主义。化学合成法在1954年被提出，并且经过了多次改进但仍然无法避免重金属等有害试剂的使用。随着生物技术的发展，利用生物催化技术合成药物活性成分由于具有反应条件温和、选择性高、绿色环保等优点，而得到极大关注。而近30年来，酶法合成熊去氧胆酸也被广泛报道，相对于前两种方法，酶法合成熊去氧胆酸具有高立体和区域选择性、反应条件温和、绿色可持续等优点而备受关注。全酶法合成熊去氧胆酸的原料是鹅去氧胆酸，相对于熊去氧胆酸，鹅去氧胆酸廉价易得，全酶法合成熊去氧胆酸涉及两个反应：首先在7α-羟类固醇脱氢酶的催化下，鹅去氧胆酸转化为7-羰基石胆酸中间体；然后，通过7β-羟基类固醇脱氢酶，将后者还原为熊去氧胆酸。两种酶都属于短链脱氢酶家族，是烟酰胺辅酶依赖型脱氢酶。相对于辅因子nadp(h)，nad(h)是更加廉价和稳定的，使其成为大规模合成应用中脱氢酶的首选辅因子。

5、在实际的工业生产中，游离酶生物催化剂常常面临着热稳定性低、不耐有机溶剂、易受极端ph影响和易失活等问题，影响其在实际生产应用中的生产效率。随着生产工艺的不断发展，对于具有高催化性能酶催化剂的需求也在与日俱增，对酶应用的效率和经济性的要求也就越来越高。因此，这不仅需要增强酶活性、稳定性和生产力，还需要提高酶的可回收性和重复利用性。固定化酶在保持了酶特有的催化性能的同时，还具有稳定性高、分离回收操作简单、可重复使用等一系列优点。与传统的搅拌式反应器相比较，连续流填充床反应器技术可以有效强化酶催化的生化反应过程，同时，连续流反应器与固定化酶的结合使酶催化的反应和酶的回收操作在同一个操作单元中完成，简化操作流程，并可降低产物对酶的抑制效应，提高酶催化剂的生产力。

6、2018年，许建和等对来自瘤胃球菌(ruminococcus torques)的rt7β-hsdh进行辅酶偏好性改造，通过理性设计，实现了rt7β-hsdh的辅因子特异性从nadph 到nadh的翻转，得到nadh依赖型变体rt7β-hsdhg39d/t17a，打破了已有报道中7β-hsdh都是nadph依赖性酶的现状(acs catal.,2019,9:466–473)。随后， arends等利用数据库挖掘策略，从lactobacillus spicheri克隆出一个天然nadh依赖型7β-hsdh(ls7β-hsdh)(chemsuschem,2019,12:3192–3203)。然而， rt7β-hsdhg39d/t17a和ls7β-hsdh的比活力均小于6u/mg，仅能催化10g/l 7-羰基石胆酸转化为熊去氧胆酸，难以实现工业规模化应用。2019年，monti小组还发现了其他几种nadh依赖性7β-hsdh，但尚未探索它们在酶促合成熊去氧胆酸中的应用(adv.synth.catal.,2020,362:2474–2485)。

7、综上所述，利用7β-羟基类固醇脱氢酶酶促合成熊去氧胆酸已被广泛报道，并取得了一定进展。酶法合成熊去氧胆酸具有选择性高和环境友好等优势，但是也存在许多不足之处。相对于nadph依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶，目前已知的nadh 依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶存在着催化活性较低，底物和产物耐受浓度低、稳定性差以及生产效率低等问题。因此，还需要开发出催化性能更好的nadh依赖型 7β-羟基类固醇脱氢酶，在此基础上制备具有高稳定性和催化性能的固定化酶，进而利用工程化手段强化7β-羟基类固醇脱氢酶催化的生化反应过程，来实现熊去氧胆酸的高效经济合成，从而满足工业化应用需求。

技术实现思路

1、本发明所要解决的问题是针对现有技术中7β-羟基类固醇脱氢酶的不足，通过挖掘、改造提供一种催化性能卓越的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组7β-羟基类固醇脱氢酶催化剂，7β-羟基类固醇脱氢酶或重组7β-羟基类固醇脱氢酶催化剂在合成熊去氧胆酸中的应用，制备具有高稳定性和催化效率的7β-羟基类固醇脱氢酶/异丙醇脱氢酶共固定化酶催化剂，以及构建高效酶法合成熊去氧胆酸的连续流填充床反应器系统，应用连续流填充床反应器系统催化7-羰基石胆酸还原制备熊去氧胆酸的方法。本发明中，还结合辅因子nad(h)回收再利用系统提高熊去氧胆酸的生物合成过程的经济性和绿色可持续性。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的技术方案之一：

4、一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

5、(a)：由seq id no.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

6、(b)：由seq id no.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加了一个或多个氨基酸而得到的具有7β-羟基类固醇脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

7、所述蛋白质(a)来源于roseococcus sp.，其编码基因如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示，命名为rs7β-hsdh。该酶具有很高的稳定性，40℃条件下，其半衰期达15h。

8、蛋白质(a)编码基因的核苷酸序列由金斯瑞公司全基因合成所得，编码区两端分别添加了ndeⅰ和hindⅲ限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶ndeⅰ和hindⅲ双酶切后，在t4 dna连接酶作用下，与同样被限制性内切酶ndeⅰ和hindⅲ双酶切的pet28a(+)载体进行连接，随后，进行转化和筛选，得到转化阳性质粒pet28a(+)-rs7β-hsdh的e.coli bl21(de3)菌株，完成 rs7β-hsdh的异源表达体系构建。

9、7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，是通过定向进化的技术方法获得的，即利用理性设计、定点突变和组合突变等定向进化技术获得活性和稳定性提高的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，具体的，高活性突变体的序列如下所示：

10、(1)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第28位甘氨酸替换为丙氨酸；

11、(2)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸；

12、(3)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第114位苏氨酸替换为甘氨酸；

13、(4)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第116位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸；

14、(5)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第124位苏氨酸替换为缬氨酸；

15、(6)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第132位丙氨酸替换为谷氨酰胺；

16、(7)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第135位缬氨酸替换为亮氨酸；

17、(8)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸，第 124位苏氨酸替换为缬氨酸；

18、(9)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸，第 135位缬氨酸替换为亮氨酸；

19、(10)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第116位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，第124位苏氨酸替换为缬氨酸；

20、(11)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第124位苏氨酸替换为缬氨酸，第 135位缬氨酸替换为亮氨酸；

21、(12)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸，第116位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸。

22、本发明的技术方案之二：

23、一种编码所述7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体的核酸。

24、本发明所述核酸编码表达如技术方案一所述的7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体，其制备方法为本领域的常规制备方法，所述的制备方法较佳的包括：

25、通过基因克隆技术获得如技术方案一所述的7β-羟基类固醇脱氢酶的编码 dna；或者通过人工全序列合成的方法得到所述7β-羟基类固醇脱氢酶的编码 dna。

26、本发明所述的通过基因克隆技术得到编码7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体的核酸分子的方法是：以

27、上游引物序列：5’ggaattccatatggcttatgatcccctagc 3’(如seq id no.3所示)

28、下游引物序列：5’cccaagcttaagcttttagtggccaaaca 3’(如seq id no.4所示)

29、通过聚合酶链式反应(pcr)获得编码所述rs7β-hsdh的编码dna，以其为模板，以seq id no.5-18所示引物，通过pcr获得7β-hsdh单点突变体(1)-(7)的编码dna；进而以7β-hsdh单点突变体(1)-(7)的编码dna为模板，以seq id no. 5-18所示引物，通过pcr获得7β-hsdh两点突变体(8)-(11)的编码dna。

30、pcr体系(20μl)：2×primestar hs(北京宝日医生物技术有限公司)10μl，模板质粒1μl(50-100ng)，上游引物1μl，下游引物1μl，ddh2o补足至20μl。

31、pcr反应程序：(1)98℃变性3分钟；(2)98℃变性10秒，(3)55℃退火15秒， (4)72℃延伸1分钟；(5)步骤2-4共进行30个循环，最后72℃延伸5分钟，4℃保存。

32、本发明的技术方案之三：

33、一种包含本发明所述7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体核酸序列的重组表达载体，具体是一种包含本发明所述7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体核酸序列的重组表达质粒。可通过本领域常规方法构建所述的重组表达质粒，将编码本发明所述7β- 羟基类固醇脱氢酶基因的核酸序列或突变体基因的核酸序列连接于各种市场上在售的空载质粒上。所述的质粒可以是本领域常规的各种质粒，包括但不限于pet 表达载体、prsf表达载体、puc表达载体或pbr表达载体中的任意一种表达载体。对于不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。所述的7β-羟基类固醇脱氢酶基因可以操作性地克隆于所选载体中的表达调控序列下游，从而实现所述7β-羟基类固醇脱氢酶的组成型或诱导型表达。

34、较佳的，作为示例，针对大肠杆菌宿主，优选pet28a(+)质粒作为载体。可通过下述方法制得本发明所述的重组表达质粒pet28a(+)-rs7β-hsdh：通过对 rs7β-hsdh的基因进行pcr扩增，利用限制性内切酶nde i和hind iii对所得的基因序列dna片段进行双酶切，同时用限制性内切酶nde i和hind iii对空载质粒pet-28a(+)进行双酶切，回收上述酶切后的rs7β-hsdh的dna片段和空载质粒，利用t4 dna连接酶将酶切后的rs7β-hsdh的dna片段和空载质粒连接，获得含有所述rs7β-hsdh编码基因的重组表达质粒pet28a(+)-rs7β-hsdh。

35、本发明的技术方案之四：

36、一种包含本发明技术方案之三的重组表达载体的重组表达转化体。

37、本发明所述的重组表达转化体可通过将本发明所述的重组表达质粒转化至宿主细胞来制得。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、乳酸菌或丝状真菌中的任意一种宿主细胞。本发明所述的宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选为e.coli bl21(de3)。将本发明所述的重组表达质粒转化至宿主细胞e.colibl21(de3)中，即可获得目标的重组表达转化体。

38、作为示例，将本发明所述的重组表达质粒pet28a(+)-rs7β-hsdh转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，获得重组表达转化体 pet28a(+)-rs7β-hsdh/bl21(de3)。

39、本发明的技术方案之五：

40、一种重组7β-羟基类固醇脱氢酶催化剂的制备方法，所述的重组7β-羟基类固醇脱氢酶催化剂是以下形式中的任意一种：

41、(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述7β-羟基类固醇脱氢酶的转化体细胞；

42、(2)如(1)所述的转化体细胞冷冻干燥得到的冻干细胞；

43、(3)破碎含有所述7β-羟基类固醇脱氢酶的转化体细胞，制得的粗酶液；

44、(4)冷冻干燥含有所述7β-羟基类固醇脱氢酶的粗酶液，制得的粗酶粉。

45、其中，培养所述重组表达转化体的条件和方法为本领域常规的条件和方法，包括如下步骤：配制重组表达转化体生长所需的培养基，培养本发明所述的重组表达转化体，获得7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体催化剂。所述的培养基可选自本领域的常规培养基，包括但不限于tb、lb或自诱导培养基。针对重组大肠杆菌，优选培养基为tb培养基：蛋白胨12g/l，酵母膏24g/l，kh2po4 2.31g/l，k2hpo4 5g/l。优选的培养方法为：将上述技术方案构建的重组大肠杆菌，接种至含有50 μg/ml卡那霉素的tb培养基中，37℃、200rpm振荡培养12小时。按1％(v/v)接种量接入装有500ml tb培养基的2l摇瓶中，置于37℃、200rpm摇床振荡培养，当培养液的od600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，然后用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞。将收获的静息细胞使用真空冷冻干燥机冷冻干燥，即可获得含有所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的冻干细胞。将收获的静息细胞悬浮于10倍体积(v/w)的磷酸盐缓冲液(10mm，ph8.0)中，高压匀浆破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组7β-羟基类固醇脱氢酶的粗酶液。将收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻过夜，然后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到所述重组7β- 羟基类固醇脱氢酶的冻干酶粉。将所获得的冻干细胞或者冻干酶粉保存在4℃冰箱内，以便后用。

46、本发明的技术方案之六：

47、本发明提供所述的7β-羟基类固醇脱氢酶rs7β-hsdh或其突变体或的应用，所述的应用包括以下步骤：

48、将本发明所述的7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体加入到含有底物7-羰基石胆酸、辅底物葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶nad+的缓冲液中，催化7-羰基石胆酸还原为熊去氧胆酸。

49、所述的缓冲液可选自本领域的常规缓冲液，包括但不限于磷酸盐、hepes或 tris-hcl，只要ph范围为7.0～9.0即可；优选的缓冲液体系为磷酸盐，ph范围为8～9。反应温度为20～50℃，优选25～35℃。

50、所述底物的浓度为5～50g/l，所述葡萄糖的用量为底物摩尔量的1.0～2倍当量，所述辅酶nad+用量为0～0.5mm，所述7β-羟基类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶催化剂的用量为5～20g/l；

51、所述的反应进程可以采用本领域中常规的检测方法，包括但不限于高效液相色谱(hplc)、气相色谱(gc)或薄板层析(tlc)；优选的检测方法为hplc。较佳的，反应过程中间歇采样，利用液相色谱法对转化率进行分析。使用的色谱柱为c18 色谱柱()，分析条件为：以甲醇/水(含0.005％磷酸)＝75/25为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长210nm，柱温30℃。结束反应的时间以转化率不再提高的时间为准。

52、本发明的技术方案之七：

53、提供一种高稳定性的7β-羟基类固醇脱氢酶/异丙醇脱氢酶共固定化酶催化剂。

54、本发明所述的7β-羟基类固醇脱氢酶/异丙醇脱氢酶共固定化酶可通过将7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体和异丙醇脱氢酶与固定化载体通过形成共价键的方式进行固定化制得。

55、所述固定化载体为具有化学活性官能团的不溶于水的固体载体，包括但不限于环氧树脂、氨基树脂、环氧纳米四氧化三铁颗粒、氨基纳米四氧化三铁或纳米二氧化硅颗粒中的任意一种载体。

56、本发明所述的固定化载体优选为带有环氧官能团的固定化载体，更优选为环氧树脂es-103固定化载体。作为示例，将本发明所制备的7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体粗酶粉和异丙醇脱氢酶粗酶粉溶解于缓冲液中，加入环氧树脂es-103后振荡孵育，酶上的氨基和环氧树脂es-103上的环氧基团发生反应形成共价键而将 7β-羟基类固醇脱氢酶或其突变体和异丙醇脱氢酶共同固定化到环氧树脂es-103 上，制备得到具有高稳定性和催化性能的7β-羟基类固醇脱氢酶和异丙醇脱氢酶共固定化酶催化剂。

57、所述的缓冲液可选自本领域的常规缓冲液，包括但不限于磷酸盐、hepes或 trishcl；优选的缓冲液体系为磷酸盐。磷酸盐缓冲盐的ph范围为5.0～10.0,优选为ph 7.0。固定化温度为15～40℃，优选20℃。7β-羟基类固醇脱氢酶和异丙醇脱氢酶冻干酶粉的质量比为5:1～1:5，优选2:1。7β-羟基类固醇脱氢酶和异丙醇脱氢酶冻干酶粉的总添加量为每克环氧树脂es-103添加20～120mg酶粉，优选每克环氧树脂es-103添加60mg酶粉。固定化时间为1～25小时，优选20小时。

58、本发明的技术方案之八：

59、提供一种高效酶法合成熊去氧胆酸的连续流填充床反应器系统。

60、本发明所述的连续流填充床反应器系统用于酶法高效合成熊去氧胆酸。为实现上述目的，本发明提供一种填充床式连续流反应器反应系统，包括反应原料7-羰基石胆酸溶解储罐、物料输送管路、物料输送泵、酶填充柱以及产物收集罐。所述原料储罐出口与物料输送泵入口连通，物料输送泵出口与酶填充柱入口连通，酶填充柱的出口与产物储罐连通。所述酶填充柱置于温控系统中，温度控制系统设置温度为20～35℃，优选25℃。优选地，所述酶填充柱的内径为0.46cm，酶填充柱的高度为15cm。所述酶填充柱的填充物为如本发明技术方案七所述的7β-羟基类固醇脱氢酶/异丙醇脱氢酶共固定化酶催化剂。反应原料储罐中的7-羰基石胆酸底物溶液通过物料输送泵输送进入酶填充柱中，在酶填充柱中底物7-羰基石胆酸被还原生成熊去氧胆酸并流出酶填充柱，流出的溶液通过物料输送管路进入到产物储罐里。所述酶填充柱反应器重复使用31天，转化率维持在95-98％，未观察到活力下降，显示了固定化酶的高度稳定性。

61、本发明的技术方案之九：

62、提供一种酶法合成熊去氧胆酸过程中辅因子nad+/nadh回收再利用方法。在技术方案八的基础上，本发明提供一种产物熊去氧胆酸分离以及辅因子nad+/nadh循环回收再利用的方法，具体操作步骤为：

63、第一步，用1m的盐酸将产物储罐中的反应液酸化到反应液的ph 2～5，优选 ph为3，降低熊去氧胆酸在反应液中的溶解度,使产物熊去氧胆酸析出；

64、第二步，将所述的酸化后的反应液过滤分离，分离得到的滤渣为产物熊去氧胆酸；

65、第三步，过滤后的滤液中包含辅因子nad+/nadh，用1m的氢氧化钠调节滤液ph为7.5～8.5，优选调节滤液的ph到8.0，滤液的ph用ph分析设备检测。

66、第四步，在所述ph为8.0的滤液中补充加入7-羰基石胆酸得到7-羰基石胆酸反应原料底物溶液，返回到7-羰基石胆酸原料储罐中进行新的反应。

67、与现有技术相比，本发明的创新改进效果在于：

68、本发明提供了一种活性高、热稳定和化学稳定性好的nadh依赖性7β-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶/异丙醇脱氢酶共固定化酶，其能够高效催化 7-羰基石胆酸还原为熊去氧胆酸，构建连续流填充床反应器系统可以以高时空产率催化合成熊去氧胆酸，辅因子回收再利用系统提高有效熊去氧胆酸生物合成的物料成本，提高熊去氧胆酸生物合成经济性和可持续性。相对于以往报道的7β-羟基类固醇脱氢酶和酶促反应体系和设备，本发明所述的7β-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶/异丙醇脱氢酶共固定化酶以及配有辅因子回收再利用系统的连续流填充床反应器系统能在高底物上载量下，利用比nadp(h)廉价的nad(h)作为辅因子高效还原7-羰基石胆酸，因此，降低了生产的成本，具有很好的工业应用前景。