小鼠源细胞STR检测试剂盒、方法及应用与流程

小鼠源细胞str检测试剂盒、方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术中的基因检测领域，具体涉及一种小鼠源细胞str检测试剂盒、方法及应用。


背景技术：

2.目前，str作为一个重要的遗传标记系统，已广泛应用于肿瘤生化研究、法医学个体识别、亲权鉴定和群体遗传学分析等领域。str具有高信息量，在基因组中广泛分布，可以用pcr扩增、电泳分型等方法加以检测，在很短的时间内str已广泛应用于生物学各领域，并取得了惊人的进展。
3.细胞是一种特殊的商品，它具有可复制性，很容易被商家自行复制后再出售，但是细胞传代的次数、培养的条件以及是否有交叉污染等都无法得到保障。小鼠细胞系在实验室被使用的频率仅次于人源细胞，并广泛被应用于人类疾病研究、重组蛋白工业和干细胞研究中。保证小鼠源细胞使用的准确性，对实验的研究起着至关重要的作用。目前str基因分型已经被atcc、dsmz等权威机构作为金标准应用于细胞株鉴定，关于str(short tandem repeat，短串联重复序列)它由长度为3～7个碱基对的短串连重复序列组成，这些重复序列广泛存在于人类基因组中，可作为高度多态性标记，被称为细胞的dna指纹。根据所得的str分型结果与细胞str数据库比对从而推算出被检样品所属的细胞系名称。因此近年来，权威期刊如nature和science为了避免因细胞错误导致的科学数据失真问题，普遍要求作者对所使用的细胞提供来源说明和鉴定结果。利用多重荧光pcr技术进行str分型及鉴定是目前应用最广泛的方法，小鼠源细胞str鉴定的位点有18-3,4-2,6-7,19-2,1-2,7-1,1-1,3-2,8-1,17-2,12-1,5-5，x-1,13-2,2-1,15-3,6-4,11-2共18个str位点，以上18个str位点可以为小鼠源细胞进行str分型及鉴定。由于细胞培养时容易发生人源细胞，小鼠源细胞，支原体交叉污染。对小鼠源细胞多个位点同时鉴定是否含有人源细胞污染或支原体污染是必不可少的，但目前市面上尚未推出小鼠源细胞str鉴定且同时可以检测人源、小鼠源污染的相关产品。同时，细胞str鉴定所需要应用的多重荧光pcr技术，使用该技术需要合成与str位点数相同的荧光引物，这样使试剂成本大大提高。
4.因此推出一款可以同时检测人源、小鼠源和支原体污染的小鼠源细胞str鉴定试剂盒有着很好的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供一种小鼠源细胞str的检测试剂盒，该试剂盒可以实现对多个str位点同时检测，进一步还可以同时实现对一个人源位点和1个支原体位点进行检测，且成本低。
6.实现上述目的的技术方案包括如下。
7.一种小鼠源细胞str的检测试剂盒，包括四对荧光通道引物和针对至少一个小鼠源细胞str鉴定位点的通用引物，所述通道引物如seq id no.1-seq id no.8所示的核苷酸
no.48所示。
38.在其中一些优选的实施例中，所述人源细胞检测引物用于通道2。
39.本发明的另一个目的是提供一种小鼠源细胞str的检测方法。
40.一种小鼠源细胞str的检测方法，包括以下步骤：
41.配置扩增反应体系：将上述试剂盒中所有引物稀释后混合，与待检测样本的dna模板和反应试剂混合；
42.进行荧光pcr扩增；
43.对荧光pcr扩增的产物进行毛细管电泳检测。
44.在其中一些实施例中，每条引物的工作浓度：荧光通用引物为5
±
0.5nmol/μl，针对小鼠str鉴定位点的特异性引物为1
±
0.1nmol/μl，支原体检测引物为1
±
0.1nmol/μl，人源细胞检测引物1
±
0.1nmol/μl。
45.在其中一些实施例中，扩增时的程序为：95
±
2℃，5分钟；10个循环：94
±
2℃30秒，56
±
2℃1分钟，70
±
2℃1分钟，19-21个循环：94
±
2℃30秒，61
±
2℃1分钟，70
±
2℃1分钟；终延伸：60
±
2℃40分钟。
46.本发明所述检测试剂盒和检测方法，具有以下优点：
47.1.目前市面上对于小鼠源细胞str鉴定的方法体系较少，检测的位点较少，体系还不成熟，目前还不可以同时鉴定18个str位点且同时鉴定是否含有人源和支原体污染，本发明可同时检测18个小鼠源位点，1个人源位点和1个支原体位点。18个小鼠源位点可用于检测待测的小鼠源细胞是否有受到小鼠源细胞污染和鉴定出待测样品是何种小鼠源细胞系，1个人源位点可用于检测待测样品是否受到人源细胞系污染，1个支原体检测位点可用于检测是否受到支原体污染。所检测的小鼠源位点与atcc和expasy公布的小鼠源细胞位点一致，本发明所测的位点全部可以用于数据比对，从而准确鉴定出小鼠源细胞具体属于哪种小鼠细胞系，实现了对小鼠源细胞进行str分型且进行细胞系鉴定。通过本发明，可以对解决市场上不能对小鼠源细胞str分型并进行细胞系鉴定的难题。
48.2.研究表明细胞培养的支原体污染中，其中95％以上污染细胞的支原体为发酵支原体(m.fermentans)、猪鼻支原体(m.hyorhinis)、口腔支原体(m.orale)、精氨酸支原体(m.arginini)、唾液支原体(m.salivarium)和人型支原体(m.hominis)。本发明所设计的检测引物，在对小鼠源细胞进行鉴定的同时可检测是否含有小鼠源细胞污染、人源细胞污染和支原体污染。其中用于支原体污染检测的引物，可以检测包括以上6种常见支原体(发酵支原体(m.fermentans)、猪鼻支原体(m.hyorhinis)、口腔支原体(m.orale)、精氨酸支原体(m.arginini)、唾液支原体(m.salivarium)和人型支原体(m.hominis))在内的30种以上支原体。一次扩增即可检测小鼠源，人源和支原体污染，大大提高了实验效率，也避免了多次实验可能造成的二次污染问题。
49.3.细胞str鉴定体系是建立在多重荧光pcr技术上的，该技术的主要成本在于荧光引物的合成，荧光引物的合成成本较高。传统的str体系建立，使用多重荧光pcr技术，有多少个str位点即需要多少条荧光引物，而本发明与传统的多重荧光pcr技术相比，仅需使用4条荧光引物，不需要众多的荧光引物，检测位点的特异引物均为普通引物。在扩增的期间，荧光通道引物与检测位点引物所扩增出来的特异性dna片段(linker)相结合，使扩增出来的特异性dna片段带上荧光信号，带荧光的dna片段可以用于下一步的毛细管电泳检测。本
发明可以大大节省荧光引物的成本，从而减少成本。
附图说明
50.图1为test1细胞str分型图。
51.图2为test1细胞str分型结果的各个位点输入到expasy在线数据库进行比对示意图。
52.图3为test11细胞str分型结果比对后的数据示意图。
53.图4为4t1细胞str分型图。
54.图5为4t1细胞str分型结果的各个位点输入到expasy在线数据库进行比对示意图。
55.图6为4t1细胞str分型结果比对后的数据示意图。
56.图7为3t3细胞str分型图。
57.图8为3t3细胞str分型结果的各个位点输入到expasy在线数据库进行比对示意图。
58.图9为3t3细胞str分型结果比对后的数据示意图。
59.图10为小鼠源细胞str鉴定试剂盒位点排布示意图。
60.图11为实施例3中单通道上机结果示意图。
61.图12为实施例3中单管四通道上机结果示意图。
62.图13为实施例4中样本llc检测结果示意图。
63.图14为实施例4中样本mus检测结果示意图。
64.图15为实施例4中样本mec-03检测结果示意图。
具体实施方式
65.本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
66.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
67.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
68.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。以下实施例为本发明较优的实施方式，但是本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与基本思想下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应视为等效的置换方式，都应包含在本发明的保护范围之内。
69.下面结合具体实施例子对本发明进行详细说明。以下实施例子将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。
70.本发明的一些实施例中，涉及一种小鼠源细胞str鉴定的检测试剂盒和检测方法。该试剂盒和检测方法可同时检测18个小鼠源位点，1个人源位点和1个支原体位点，对小鼠
源细胞进行鉴定可同时检测是否含有人源细胞污染和支原体污染，大大提高了实验效率。
71.本发明设计了在每特异位点的常规引物的5’端加上了四组通道引物的一条作为linker序列，并且将其合适地分别对应四种荧光，这样只需要四组荧光引物，即可以同时扩增20个位点。同时这四组荧光通道linker的序列由同一个序列随机化后产生，它们的tm值几乎一样，这样大大降低了多重pcr扩增中的不均一性。而且本发明在检测小鼠的18个位点的同时，还可以进一步加入了一个人源位点和一个支原体位点，这样便于检测在小鼠细胞培养中经常出现的人源的细胞的污染，以及同时检测细胞是否有支原体污染。这些检测在目前其他的产品中需要分别做三次检测才能够实现。因此大大节省了检测的时间。本发明仅需使用4条荧光通道引物，其余引物均为普通引物，与其他多重荧光pcr技术相比，大大节省试剂成本。本发明所设计的引物分为荧光通用引物(带荧光)，小鼠str位点特异性引物(不带荧光)，支原体检测引物(不带荧光)及人源细胞检测引物(不带荧光)。本发明所设计引物的重点在：1.四组荧光通道引物能分别结合到20对特异引物5'端的通用linker序列，从而在多重扩增中能扩增出带有荧光的特异位点的产物。2.荧光通用引物是由一条引物序列随机化产出，具有同样的gc含量和tm值，因此能够更均一地扩增20个不同的特异基因位点。3.荧光通道的引物须与小鼠str位点特异性引物，支原体检测引物，人源细胞检测引物所扩增出的dna片段进行结合，使扩增出的dna片段带上荧光基团，这些带荧光基团的dna片段在进行毛细管电泳时被检测出来。4.本发明的荧光通道引物与其他str检测体系和试剂盒相比，本发明仅在4条荧光引物的条件下即可对所有检测的位点所扩增的dna片段带上荧光信号，即可用于毛细管电泳检测。5.本产品可以同时检测细胞株是否有人源细胞和支原体污染。
72.本发明所述所述试剂盒和检测方法，可以用于检测待测样品是否为小鼠细胞，是否存在小鼠物种内的交叉污染；是否存在人源细胞污染；是否存在支原体污染；对已公布str数据的小鼠细胞进行小鼠细胞株鉴定。
73.本发明的以下实施例中所述小鼠源细胞str鉴定试剂盒的检测位点排布如图10所示。
74.实施例1
75.(1)扩增引物如下：
76.荧光通道引物：
77.[0078][0079]
小鼠str位点特异性引物：下划线阴影部分为通用linker序列，和荧光通用引物结合。
[0080]
[0081][0082]
支原体(mycoplasm)检测引物
[0083][0084]
人源细胞检测引物
[0085][0086]
将所有引物稀释后混合，混合引物体系最终浓度：荧光通道引物为5nmol/μl，小鼠str位点特异性引物为1nmol/μl，支原体检测引物为1nmol/μl，人源细胞检测引物1nmol/μl。
[0087]
(2)扩增反应体系如下：
[0088]
基因组dna2-50ng2.5x多重pcr reaction mix10.0μlprimers mix5.0μl热启动taq酶1.0μlddh2o补水至25.0μl
[0089]
(3)扩增程序如下：
[0090]
[0091][0092]
细胞悬液，细胞沉淀用基因组提取试剂盒(艾基生物)抽提全基因组dna，微量紫外可见分光光度计(赛默飞nanodrop 2000c)qc检测dna浓度。使用小鼠str鉴定试剂盒进行多荧光体系复合扩增(abi9700 pcr system)，使用abi3730xl遗传分析仪(美国abi公司)进行毛细管电泳、片段分离并采用id软件(版本号：id-x 1.5)进行基因型分析。因各型号pcr仪性能不同，循环参数中的退火温度可适当调整，调整范围
±
2℃内。
[0093]
毛细管电泳检测如下：
[0094]
pcr扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μl pcr扩增产物与0.5μl liz-500和9.5μl去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟后冰浴，毛细管电泳检测。毛细管电泳检测参数为abi3730xl毛细管电泳仪中片段分析的默认参数。
[0095]
(4)数据分析：
[0096]
使用abi提供的id(软件版本：id-x 1.5)片段分析软件对原始数据进行str基因分型。获得str基因分型后根据str位点的峰判断被检小鼠源细胞是否含有人源，小鼠源或支原体污染。根据atcc和expasy公布的小鼠源细胞str数据与得到的被检小鼠源细胞的str分型数据进行比对，鉴定出被检小鼠源细胞的为哪种细胞系。
[0097]
实施例2
[0098]
一、样品信息：
[0099]
(1)样本名称：test1细胞或4t1细胞或3t3细胞
[0100]
(2)样本类型：细胞沉淀
[0101]
(3)样品种属：小鼠源细胞
[0102]
二、实验流程：
[0103]
(1)基因组提取：细胞沉淀用基因组提取试剂盒(试剂盒产家：广州艾基生物技术有限公司，k316-s)抽提全基因组dna，微量紫外可见分光光度计(仪器型号：赛默飞nanodrop 2000c)qc检测dna浓度。
[0104]
(2)多重荧光pcr技术扩增：使用实施例1所述的实试剂盒和检测方法(扩增引物配比，pcr体系，pcr扩增程序)进行多荧光体系复合扩增(仪器型号：abi9700 pcr system)。
[0105]
(3)毛细管电泳：使用abi3730xl遗传分析仪(美国abi公司)进行毛细管电泳。
[0106]
(4)数据分析：原始数据分析采用id软件(软件版本：id-x 1.5)进行str基因型分析。数据比对使用expasy发布的小鼠源细胞str分型数据。
[0107]
三、实验结果：
[0108]
(1)test1细胞str分型图如图1所示。
[0109]
根据被检样品test1的str分型图谱，本次被检样品的峰图情况简要分析见下表：
[0110][0111]
备注：如某个(或多个)str位点出现超过2个等位基因，其可能原因：1、所测细胞基因组不稳定，部分细胞str位点发生改变(如体外长期培养的肿瘤细胞)；2、由于减数分裂或有丝分裂过程的异常分离导致的染色体三体或镶嵌；3、所测细胞污染了其他遗传背景的细胞(有3个以上str位点出现超过2个等位基因)
[0112]
str分型结果
[0113][0114]
比对结果:
[0115]
将str分型结果的各个位点输入到expasy在线数据库进行比对，数据如图2所示。
[0116]
未检测到支原体和人源位点的信号，被检样品未被支原体和人源细胞污染。被检样品test1的18个str位点与raw 264.7小鼠源细胞系匹配度达到100％，被检样品属于raw 264.7小鼠源细胞系，数据比对如图3所示。
[0117]
(2)4t1细胞str分型图如图4所示。
[0118]
将str分型结果的各个位点输入到expasy在线数据库进行比对，数据如图5所示。检测到支原体位点的信号，未检测到人源位点的信号，被检样品被支原体污染；被检样品未被人源细胞污染。被检样品4t1的18个str位点与4t1小鼠源细胞系匹配度达到100％，被检样品属于4t1小鼠源细胞系，数据比对如图6所示。
[0119]
(3)3t3细胞str分型图如图7所示。
[0120]
将str分型结果的各个位点输入到expasy在线数据库进行比对，数据如图8所示。未检测到支原体和人源位点的信号，被检样品未被支原体和人源细胞污染。被检样品3t3的18个str位点与nih3t3小鼠源细胞系匹配度达到100％，被检样品属于nih3t3小鼠源细胞系，数据比对如图9所示。
[0121]
实施例3
[0122]
对实施例2中test1细胞样本进行检测。
[0123]
按照以下表格3.1各通道特异引物的组成进行配置。
[0124]
表3.1各通道特异引物的配制
[0125][0126]
注：括号中的内容为位点名称
[0127]
按照单通道和单管四通道进行pcr反应体系配置：
[0128]
表3.2单通道pcr反应体系
[0129]
[0130][0131]
表3.3单管四通道pcr反应体系
[0132][0133]
pcr反应程序：
[0134]
95℃，3min；(94℃,30s；61℃,2min)x32cycles(循环)；60℃,30min；12℃,保存。
[0135]
结果参见图11和图12。
[0136]
由图11结果可以看出，各通道中的基因位点已基本实现成功扩增；但扩增的效率不是特别的平衡，小片段位点的扩增效率较高，而大片段位点的扩增效率较低。
[0137]
由图12结果可以看出，在排除由于窜通道所造成各通道多出来的荧光条带(rox的信号有窜通道)，进行单管四通道扩增时，大多数基因位点都可以得到有效扩增，检测结果优于单管扩增，但有些信号值相对单管扩增时较低，扩增体系和扩增程序有待优化；其检测结果不如按照实施例1所示的扩增体系和扩增程序。
[0138]
实施例4样本检测
[0139]
4.1.对样本llc进行检测
[0140]
样本名称：llc
[0141]
样本类型：细胞沉淀
[0142]
按照实施例1所述方法进行检测，str分型结果参见图13。
[0143]
从图13可以看出，检测的18个小鼠str位点中发现4个位点超过两个等位基因峰。根据：如某个(或多个)str位点出现超过2个等位基因，其可能原因：1、所测细胞基因组不稳定，部分细胞str位点发生改变(如体外长期培养的肿瘤细胞)；2、由于减数分裂或有丝分裂过程的异常分离导致的染色体三体或镶嵌；3、所测细胞污染了其他遗传背景的细胞(有3个以上str位点出现超过2个等位基因)，被检小鼠细胞株存在小鼠细胞系的污染。检测到支原体位点存在较高信号的峰，被检样品存在支原体污染。
[0144]
4.2.对样本mus进行检测
[0145]
样本名称：mus
[0146]
样本类型：细胞沉淀
[0147]
按照实施例1所述方法进行检测，str分型结果参见图14。
[0148]
从图14可以看出，检测的18个小鼠str位点中发现11个位点超过两个等位基因峰。根据：如某个(或多个)str位点出现超过2个等位基因，其可能原因：1、所测细胞基因组不稳定，部分细胞str位点发生改变(如体外长期培养的肿瘤细胞)；2、由于减数分裂或有丝分裂
过程的异常分离导致的染色体三体或镶嵌；3、所测细胞污染了其他遗传背景的细胞(有3个以上str位点出现超过2个等位基因)，被检小鼠细胞株存在小鼠细胞系的污染。检测到支原体位点信号的峰，被检样品存在支原体污染。检测到人源位点信号的峰，被检样品存在人源细胞系污染。
[0149]
4.2.对样本mec-03进行检测
[0150]
样本名称：mec-03
[0151]
样本类型：细胞沉淀
[0152]
按照实施例1所述方法进行检测，str分型结果参见图15。
[0153]
从图15可以看出，检测的18个小鼠str位点中发现6个位点超过两个等位基因峰。根据：如某个(或多个)str位点出现超过2个等位基因，其可能原因：1、所测细胞基因组不稳定，部分细胞str位点发生改变(如体外长期培养的肿瘤细胞)；2、由于减数分裂或有丝分裂过程的异常分离导致的染色体三体或镶嵌；3、所测细胞污染了其他遗传背景的细胞(有3个以上str位点出现超过2个等位基因)，被检小鼠细胞株存在小鼠细胞系的污染。未检测到支原体位点信号的峰，被检样品不存在支原体污染。未检测到人源位点信号的峰，被检样品不存在人源细胞系污染。
[0154]
以上对本发明的具体实施进行了描述，本发明通过使用上述提及的引物，在仅需要4条荧光引物的条件下，复合扩增出18个小鼠str位点，可以准确地鉴定出小鼠源细胞所属的细胞系。本发明在鉴定小鼠源细胞的细胞系的同时，可以检测是否被人源细胞和支原体污染。
[0155]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。