辣椒成熟果实与果柄易分离性状相关的分子标记及其应用和检测方法

1.本技术涉及分子标记领域，具体涉及辣椒成熟果实与果柄易分离性状相关的分子标记及其应用和检测方法。


背景技术：

2.辣椒(capsicum spp.)是一年生或有限多年生的茄科(solanaceae)辣椒属(capsicum)作物。越来越多的单核苷酸多态性(snps)和插入/缺失多态性(indels)被发现，促进了辣椒遗传定位、多样性分析等研究的发展。
3.果实相关离区研究一直是育种行业的热点，一方面成熟果实易脱落会对辣椒果实产量产生巨大影响，另一方面由于加工型辣椒的需求增加，果实与果柄易分离的辣椒品种的培育会便捷机械化采收，降低生产成本，提高经济效益。野生辣椒的成熟果实与果柄易分离，这可能是为了种子传播更加便利。绝大多数辣椒品种的成熟果实、胎座和果柄紧密相连，这可能是由于在驯化过程中，为保证辣椒果实产量，人为定向选择了成熟果实与果柄不易分离的辣椒材料。已利用多组材料杂交验证了辣椒成熟果实与果柄易分离为单基因控制的显性遗传性状，将控制该性状的基因定位在10号染色体上。但由于定位时缺乏辣椒基因组信息，并未能确定准确的物理位置，只是推测该基因与控制果实硬度的基因pg紧密连锁或相同。目前可借助已发表的辣椒基因组定位辣椒中控制成熟果实与果柄易分离基因物理位置。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供辣椒成熟果实与果柄易分离性状相关的分子标记。
5.本发明的再一目的是提供辣椒成熟果实与果柄易分离性状相关发分子标记的应用。
6.本发明的再一目的是提供鉴定辣椒成熟果实与果柄易分离性状的方法。
7.根据本发明的辣椒成熟果实与果柄易分离性状相关的分子标记，所述分子标记通过以下特异性引物扩增而得，
8.re-40正向引物：5’agagaagttggtgtgtttctaca3’9.re-40正向引物:5’tctttggtggatgttcacataca3’；
10.re-67正向引物:5’cgaattaggtctcaacgagcg3’，
11.re-67反向引物：5’tcaccttttcgtagggctctc3’。
12.根据本发明的鉴定辣椒成熟果实与果柄易分离性状的方法，所述方法包括使用以下辣椒成熟果实与果柄易分离性状相关的分子标记的特异性引物扩增待测样本的步骤，
13.re-40正向引物：5’agagaagttggtgtgtttctaca3’14.re-40反向引物:5’tctttggtggatgttcacataca3’；
15.re-67正向引物:5’cgaattaggtctcaacgagcg3’，
16.re-67反向引物：5’tcaccttttcgtagggctctc3’。
17.根据本发明的鉴定辣椒成熟果实与果柄易分离性状的方法，其中，使用re-40正向引物和re-40反向引物进行扩增时，如果a图显示re-40分子标记pcr扩增琼脂糖电泳结果，泳道1-7为成熟果实与果柄不易分离材料(154bp)，泳道8-14为成熟果实与果柄易分离(167bp)。
18.本发明结合bsa-seq初定位、精细定位，将控制成熟果实与果柄易分离的基因定位至10号染色体，得到了控制成熟果实与果柄易分离的基因的候选区间。并在候选区间内开发与该性状紧密连锁的分子标记，扩大群体验证了此引物确定成熟果实与果柄易分离性状的准确率。辣椒成熟果实与果柄易分离是辣椒育种工作中重要的研究热点，选育成熟果实与果柄易分离的加工型辣椒品种，可以便捷机械化采收，提高及经济效益。本发明的分子标记与辣椒成熟果实与果柄易分离基因紧密连锁，具有较高鉴定效果，此标记的开发利用使得苗期就可以鉴定出果实与果柄是否易分离。
附图说明
19.图1为成熟果实与果柄在外力作用下断裂面示意图；
20.图2显示本技术定位的两个分子标记pcr扩增琼脂糖电泳结果，其中，a：re-40分子标记pcr扩增琼脂糖电泳结果，b：.re-67分子标记pcr扩增琼脂糖电泳结果。
具体实施方式
21.对茄门、ac1979及(ac1979
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茄门)f2群体(360株)材料进行果实脱落力(fruit detachment force，fdf)测定及果实与果柄断裂面观察，将表型分为果实与果柄易分离、果实与果柄不易分离两种，如图1所示，a图显示成熟果实fdf较大且果实与果柄在外力作用下断裂时存在果皮撕裂，胎座未分离等现象为果实与果柄不易分离材料，b显示成熟果实fdf较小且果实与果柄在外力作用下断裂果皮胎座无破损、与果柄分离完整为果实与果柄易分离材料。建立了成熟果实与果柄易分离亲本池(ac1979)、成熟果实与果柄不易分离亲本池(茄门)、30株成熟果实与果柄易分离单株混池(d-q)和30株成熟果实与果柄不易分离混池(nd-q)，并进行重测序，对测序数据进行质量检测。
22.以辣椒cm334(kim et al.,2014)基因组为参考基因组，使用0.7.17版本的bwa men(qin et al.,2014)算法进行比对，过滤掉比对质量小于30的reads；使用软件gatk(bathke&luhken,2021)进行变异检测，提取质量值大于70，位点覆盖深度大于5且亲本基因型有差异的变异位点，最终得到14,480,011个有效snp位点用于bsa分析。通过计算每条染色体区间内成熟果实与果柄易分离混池(d-q)和成熟果实与果柄不易分离混池(nd-q)的snp-index值，得到δ(snp-index)值并最终定位到位于10号染色上的2mb显著关联区间。
23.将重测序数据变异检测结果与表型数据进行关联分析，在初定位区间内挖掘到2个成熟果实与果柄易分离性状紧密连锁的indel分子标记，扩增引物序列及扩增产物长度，序列碱基差异数如表1。对果实果托易分离和不易分离两种材料分别进行pcr扩增，将pcr产物进行琼脂糖电泳，电泳结果如图2所示，其中a图显示re-40分子标记pcr扩增琼脂糖电泳结果，泳道1-7为成熟果实与果柄不易分离材料(167bp)，泳道8-14为成熟果实与果柄易分离(154bp)；b图显示re-67分子标记pcr扩增琼脂糖电泳结果，泳道1-7为成熟果实与果柄不
易分离材料(137bp)，泳道8-14为成熟果实与果柄易分离材料(115bp)，m为marker 50bp。
24.表1与辣椒成熟果实与果柄易分离表型紧密连锁分子标记引物信息
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利用得到的两个与辣椒成熟果实与果柄易分离性状紧密连锁的分子标记验证一自然群体，该群体包含335份辣椒材料，其中田间表现为成熟果实与果柄易分离表型的材料有270份，其中成熟果实与果柄不易分离的材料有93份，辣椒成熟果实与果柄易分离材料有270份。利用挖掘到的两个indel分子标记验证这270份辣椒材料的成熟果实与果柄分离难易，其中re-40鉴定的准确率为94.44％，re-67鉴定的准确率为93.70％。
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以上实施例仅用于解释本技术的技术方案，不限定本技术的保护范围。